Νανοσωματίδια και βιοφωταυγείς ιχνηθέτες στην ανάλυση DNA

Abstract

The Human Genome Project revealed DNA variations that are involved in the pathogenesis of disease, disease predisposition and metabolism of drugs. Detection and characterization of these polymorphisms (genotyping) is an important goal of biomedical research, because it is related to the discovery of novel prognostic or diagnostic markers and development of individualized medicine. The present dissertation focuses on the development of novel methods for genotyping single nucleotide polymorphisms (SNPs). The methods are rapid, simple, reliable and of low cost. These methods are based: (a) on a dry reagent DNA biosensor, which enables visual detection of allele specific products, without instrumentation, and (b) on bioluminometric assay of allele specific products in microtiter wells. Detection by the DNA biosensor exploits the unique optical properties of gold nanoparticles as reporters whereas the bioluminometric method is based on an enzyme (alkaline phosphatase) reporter, combined with the appropriate substrate. The theoretical background of this dissertation is outlined in the first six chapters. Chapter 1 describes the role of gold nanoparticles in DNA analysis. The optical properties of metal and gold nanoparticles, as well as the functionalization methods of gold surface are described. Applications of functionalized gold nanoparticles in DNA analysis are also presented. Chapter 2 focuses on dry reagent biosensors. Description of their constituents, immobilization systems and ways for optical detection and processing, are reported. In chapter 3, bioluminesence and chemiluminescence are described. The usuall chemiluminescent and bioluminesent probes, as well as their applications in DNA analysis are discussed. Chapter 4 focuses on genotyping methods for single nucleotide polymorphisms. The three parts of each method are described, i.e. amplification of target sequence by the polymerase chain reaction (PCR), allele discrimination and detection of allele-specific products. In Chapter 5, the genes under study in this thesis, are presented including polymorphisms CYP2C19*2 and CYP2C19*3 of CYP2C19 gene, CYP2D6 *3 and CYP2D6*4 of CYP2D6 gene, ADRA1A and ADRB3 adrenergic receptor genes, HRH2 of histamine promoter gene and HTR2A 1 and 2 polymorphisms on serotonergic receptor. In Chapter 6 the objectives of this dissertation are presented. The experimental part of this dissertation consists of five chapters. Instrumentation, reagents and buffers that were used during the experimental work are described in Chapter 7. Chapter 8 focuses on the development of a novel method for visual genotyping of SNPs by tetra-primer PCR coupled with a dry-reagent DNA biosensor. Tetra-primer PCR allows simultaneous amplification of DNA-target and allele discrimination. As a result, reduction of the required steps for sample genotyping is achieved. Up to now slab gel electrophoresis is the only method used for detection of tetra-primer PCR products. The proposed dry-reagent biosensor provides simpler detection and confirmation of the sequence of allele-specific products, by hybridization. On the contrary, electrophoresis confirms only the size of PCR products. The objective of Chapter 9 is the development of a novel method that combines the specificity of ligation reaction for allele discrimination with the visual detection of allele-specific products by the dry-reagent disposable biosensor. The proposed method is the first which utilizes a DNA biosensor for detection of ligation products. The genotyping methods reported so far, require two sensors to detect the genotype of a single sample. In order to simplify genotyping methods, a novel DNA biosensor which enables simultaneous visual detection of two alleles in a single strip was developed (Chapter 10). The proposed biosensor was combined with ligation reaction. Finally, a novel automatable microtiter well-based bio/chemiluminometric genotyping method (Chapter 11) was developed for high-throughput genotyping. The genotyping methods were applied successfully to the genotyping of polymorphic genes involved in drug metabolism or genes of adrenergic, histamine and serotonergic receptors.

Η αποκωδικοποίηση του ανθρώπινου γονιδιώματος αποκάλυψε διαφοροποιήσεις του DNA που εμπλέκονται στην παθογένεση ασθενειών, στην προδιάθεση για διάφορες ασθένειες και στο μεταβολισμό φαρμάκων και άλλων ουσιών. Η ανίχνευση και ταυτοποίηση (γονοτύπηση) αυτών των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών αποτελεί πεδίο εντατικής έρευνας γιατί σχετίζεται άμεσα με την εύρεση νέων προγνωστικών ή διαγνωστικών δεικτών και την εφαρμογή εξατομικευμένων θεραπειών. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη νέων μεθόδων γονοτύπησης μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNP), οι οποίες είναι ιδιαίτερα απλές στην εκτέλεση, έχουν χαμηλό κόστος και εκτελούνται σε σύντομο χρονικό διάστημα. Οι μέθοδοι βασίζονται (α) σε βιοαισθητήρα DNA τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων, ο οποίος καθιστά εφικτή την άμεση οπτική ανίχνευση του προϊόντος της γονοτυπικής αντίδρασης χωρίς τη χρήση οργάνων ή (β) στη βιοφωταυγειομετρική ανίχνευση του προϊόντος της γονοτυπικής αντίδρασης σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης. Στις μεθόδους ανίχνευσης με το βιοαισθητήρα αξιοποιούνται οι οπτικές ιδιότητες νανοσωματιδίων χρυσού ενώ στη βιοφωταυγειομετρική μέθοδο χρησιμοποιείται το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση ως ιχνηθέτης, σε συνδυασμό με κατάλληλο υπόστρωμα. Το Θεωρητικό μέρος της διατριβής αποτελείται από έξι κεφάλαια. Στο Κεφάλαιο 1 περιγράφεται γενικά ο ρόλος των νανοσωματιδίων χρυσού σε αναλύσεις DNA. Αρχικά αναφέρονται οι οπτικές ιδιότητες των μεταλλικών νανοσωματιδίων και ακολουθεί η περιγραφή των νανοσωματιδίων Au, με έμφαση στις τεχνικές τροποποίησης της επιφάνειάς τους. Τέλος, παρουσιάζονται εφαρμογές τροποποιημένων νανοσωματιδίων Au σε μεθόδους ανάλυσης DNA. Στο Κεφάλαιο 2 περιγράφονται οι βιοαισθητήρες τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Αναφέρονται τα υλικά κατασκευής τους, τα συστήματα ακινητοποίησης των αναλυόμενων μορίων και οι τρόποι οπτικής ανίχνευσης και επεξεργασίας των αποτελεσμάτων. Στη συνέχεια (Κεφάλαιο 3) παρουσιάζονται τα φαινόμενα της βιοφωταύγειας και χημειοφωταύγειας. Παρατίθενται οι συνηθέστεροι ιχνηθέτες και αναφέρεται η εφαρμογή τους σε αναλύσεις DNA. Αντικείμενο του Κεφαλαίου 4 είναι οι μέθοδοι γονοτύπησης νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Περιγράφονται τα τρία διακριτά στάδια κάθε μεθόδου γονοτύπησης, δηλαδή ο πολλαπλασιασμός των αλληλουχιών-στόχων με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR), η διάκριση (διαφοροποίηση) των διαφορετικών αλληλίων με κατάλληλες αντιδράσεις και οι μέθοδοι ανίχνευσης των αντίστοιχων προϊόντων. Στο Κεφάλαιο 5 παρουσιάζονται τα γονίδια και οι πολυμορφισμοί που μελετήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας διατριβής. Αναλύθηκαν οι πολυμορφισμοί CYP2C19*2 και CYP2C19*3 στο γονίδιο CYP2C19, CYP2D6*3 και CYP2D6*4 στο γονίδιο CYP2D6, ADRA1A και ADRB3 στα αντίστοιχα γονίδια αδρενεργικών υποδοχέων, HRH2 στον προαγωγέα του γονιδίου του ισταμινικού υποδοχέα και οι HTR2A 1 και 2 στο γονίδιο του σεροτονεργικού υποδοχέα. Στο Κεφάλαιο 6 παρουσιάζονται οι στόχοι της διδακτορικής διατριβής. Το Πειραματικό μέρος της παρούσας διατριβής αποτελείται από πέντε κεφάλαια. Στο Κεφάλαιο 7 παρατίθενται τα όργανα, τα αντιδραστήρια και τα διαλύματα, που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της πειραματικής εργασίας. Στο Κεφάλαιο 8 περιγράφεται η ανάπτυξη μεθόδου η οποία συνδυάζει την αλληλομορφο-ειδική PCR τεσσάρων εκκινητών με τον προαναφερθέντα βιοαισθητήρα DNA. Η PCR τεσσάρων εκκινητών πλεονεκτεί έναντι άλλων μεθόδων στο ότι η διάκριση των αλληλίων πραγματοποιείται κατά τη διάρκεια του εκθετικού πολλαπλασιασμού του DNA και έτσι δεν απαιτείται ξεχωριστή αντίδραση γονοτύπησης. Όμως, μέχρι τώρα η ανάλυση των προϊόντων PCR τεσσάρων εκκινητών διεξάγεται με ηλεκτροφόρηση. Με τη χρήση βιοαισθητήρα απλοποιείται σε μεγάλο βαθμό η γονοτύπηση SNP και επιπλέον παρέχεται η δυνατότητα επιβεβαίωσης της αλληλουχίας των προϊόντων, μέσω υβριδοποίησης, σε αντίθεση με την ηλεκτροφόρηση η οποία παρέχει μόνο το μέγεθος του παραγόμενου DNA. Στη συνέχεια (Κεφάλαιο 9) αναπτύχθηκε μέθοδος που συνδυάζει την εξειδίκευση της αντίδραση λιγάσης στη διαφοροποίηση αλληλίων και την οπτική ανίχνευση των προϊόντων της αντίδρασης με βιοαισθητήρα DNA τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Η αντίδραση λιγάσης έχει συνδυαστεί με πληθώρα μεθόδων ανίχνευσης των προϊόντων αλλά είναι η πρώτη φορά που συνδυάζεται με βιοαισθητήρα τέτοιου τύπου. Στις προηγούμενες μεθόδους γονοτύπησης μέσω βιοαισθητήρων ξηρών αντιδραστηρίων, απαιτούνται δύο αισθητήρες για τον προσδιορισμό του γονοτύπου ενός δείγματος. Στην προσπάθειά για περαιτέρω απλοποίηση των μεθόδων γονοτύπησης αναπτύχθηκε (Κεφάλαιο 10) πρωτότυπος βιοαισθητήρας DNA για την ταυτόχρονη ανίχνευση δύο αλληλίων με έναν αισθητήρα. Ο νέος βιοαισθητήρας συνδυάστηκε με την αντίδραση λιγάσης. Τέλος, η ανάπτυξη φωταυγειομετρικής μεθόδου γονοτύπησης σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης (Κεφάλαιο 11) κρίθηκε αναγκαία για την ανάλυση πληθώρας δειγμάτων ταυτόχρονα με προοπτική πλήρους αυτοματοποίησης. Οι μέθοδοι οι οποίες αναπτύχθηκαν στα πλαίσια της διατριβής εφαρμόστηκαν επιτυχώς στη γονοτύπηση πολυμορφισμών γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό φαρμάκων ή γονιδίων αδρενεργικών, ισταμινικών και σεροτονεργικών υποδοχέων.