Πρωτεϊνική μηχανική και χαρακτηρισμός του ενζύμου μεταφοράση του γλουταθείου

Abstract

A GST isoezyme (GmGSTU4-4) belonging to tau class from Glycine max was expressed in Ε. coli purified by affinity chromatography and its structural and catalytic properties were investigated. Steady state kinetic analysis for selected substrates was carried out and the kcat and Km parameters were determined. The purified GmGSTU4-4 isoenzyme was subjected to structural determination using X-ray crystallography. Site directed mutagenesis was used to evaluate the role of Ser13, Asn48, Pro49, Tyr107 and Arg111 in catalysis. The mutants Ser13Ala, Asn48Ala, Pro49Ala, Tyr107Ala, Arg111Ala were expressed in Ε. colt purified and their kinetic properties were investigated by steady state kinetic analysis. The results established the direct or indirect involvement of these residues in the catalytic mechanism. In order to create in vitro enzyme variants with desired properties such as enhanced enzyme activity towards specific xenobiotic compounds GmGSTU4-4, GmGST2 and GmGST10 from Glycine max were subjected to directed evolution using DNA shuffling. A library of mutant enzymes was created. The library was screened using activity assays for the substrates CDNB fluorodifen and cumene hydroperoxide. The mutant Sh14 which showed 10 times higher specific activity toward fluorodifen was chosen for further analysis. The 3D structure of Sh14 in complex with S-(p-nitrobenzyl)-glutathione was determined by X-ray crystallography. Sh14 compared to GmGSTU4-4 contains four mutations with Trp114Cys being the most important. Using site directed mutagenesis Cys114 was mutated to Trp as in wild type GmGSTU4-4. The mutated enzyme Cys114Trp was purified and characterized by steady state kinetic analysis. The results showed that the kinetic properties of the mutant enzyme were more similar to GmGSTU4-4 rather than Sh14. Therefore, restoring of the residue at position 114 brings back the kinetic characteristics of the wild type and verifies the suggestion that the mutation at the site 114 is the one responsible for the different kinetic properties of Sh14 compared to GmGSTU4-4. The Sh14 and the wild type enzyme GmGSTU4-4 were subjected to chemical modification using phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) and sodium hydrogen selenide (NaHSe). The selenium containing enzyme seleno Sh14 was characterized and the results showed that the specificity constant (kcat/Km) of the enzyme for CuOOH is much higher than that of GmGSTU4-4 and Sh14 respectively. In the final chapter the directed evolution using DNA shuffling of the enzymes GSTA1-1 from human and GSTA1-1 from rat is presented. From the generated library one mutant (D4) that exhibited high activity was selected for further study. The results showed that the mutant D4 exhibits high affinity for GSH. Saturation mutagenesis at position 112 of D4 was carried out aiming at creating a more resistant to oxidation form of the enzyme. Ninety two mutants of the generated library were selected and assessed for their expression level and enzyme activity. After the selection and characterization of the mutants the form Cys112Ser was selected. The results showed that the form Cys112Ser exhibited high affinity for GSH and resistant to oxidation by Cu⁺² and Η₂Ο₂. compared to the wild type enzymes. Finally, equilibrium adsorption studies were also carried out using the above enzymes on the affinity adsorbent BES GSH.

Πραγματοποιήθηκε μοριακή και κινητική μελέτη του ισοενζύμου GmGSTU4-4 από Glycine max. Ειδικότερα πραγματοποιήθηκε ετερόλογη έκφραση σε Ε. coli και καθαρισμός του ενζύμου μέσω χρωματογραφίας συγγένειας. Πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της καταλυτικής αντίδρασης και προσδιορίστηκαν οι κινητικές σταθερές για διαφορετικά υποστρώματα. Μελετήθηκε και αναλύθηκε η τρισδιάστατη δομή του ενζύμου και επιλέχτηκαν τα αμινοξικά κατάλοιπα Ser13, Asn48, Pro49, Tyr107, Arg111 τα οποία αποτέλεσαν στόχο κατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης. Οι μεταλλαγμένες μορφές Ser13Ala, Asn48Ala, Pro49Ala, Tyr107Ala, Arg111Ala εκφράστηκαν σε Ε. coli καθαρίστηκαν και χαρακτηρίστηκαν με κινητική ανάλυση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα παραπάνω αμινοξικά κατάλοιπα συμμετέχουν άμεσα η έμμεσα στον καταλυτικό μηχανισμό. Επίσης, μελετήθηκε η αναστολή της ενζυμικής δραστικότητας από μεγάλη ποικιλία ξενοβιοτικών ενώσεων (φυτοφάρμακα, εντομοκτόνα τριαζινο χρωστικές). Στη συνέχεια έγινε ανασχεδιασμός του ενζύμου GmGSTU4-4 εφαρμόζοντας κατευθυνόμενη εξέλιξη. Ειδικότερα, πραγματοποιήθηκε κατευθυνόμενος εξελικτικός ανασχεδιασμός των γονίδιων τριών ισοενζύμων GmGSTU4-4, GmGST2, GmGST10 από Glycine max με τη μέθοδο της ανασυναρμολόγησης του DNA. Προέκυψε βιβλιοθήκη διαφορετικών μεταλλαγμένων μορφών και πραγματοποιήθηκε έλεγχος ενζυμικής δραστικότητας και προσδιορισμός της ειδικής δραστικότητας έναντι του 1-χλωρο-2,4-δινιτροβενζολίου του ζιζανιοκτόνου fluorodifen και του υπεροξειδίου του κουμενίου. Επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη η μορφή Sh14 η οποία εμφανίζει κατά περίπου 10 φορές υψηλότερη δραστικότητα έναντι του fluorodifen. Μελετήθηκε κινητικά και αναλύθηκε η τρισδιάστατη δομή του ενζύμου και διαπιστώθηκε ότι από τις τέσσερις μεταλλάξεις που διαφοροποιούν τον άγριο τύπο από τη μορφή Sh14 αυτή που πιθανότατα επηρεάζει τις κινητικές σταθερές είναι η Trp114Cys. Το παραπάνω συμπέρασμα επιβεβαιώθηκε και με κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση. Η μορφή Sh14 (καθώς και ο άγριος τύπος του ένζυμου) υποβλήθηκαν σε χημική τροποποίηση χρησιμοποιώντας τα αντιδραστήρια Φαινυλο-μεθυλο-σουλφονυλο-φθορίδιο και όξινο σεληνιούχο νάτριο και έγινε έλεγχος στο τροποποιημένο ένζυμο δραστικότητας έναντι του υδρουπεροξειδίου του κουμενίου. Η χημικά τροποποιημένη μορφή Sh14 επέδειξε σημαντική αύξηση στη σταθερά εξειδίκευσης για το υπόστρωμα υδρουπεροξείδιο του κουμενίου. Επίσης πραγματοποιήθηκε κατευθυνόμενη εξέλιξη των ισοενζύμων GSTA1-1 από άνθρωπο και αρουραίο με τη μέθοδο της ανασυναρμολόγησης του DNA. Από τη διαδικασία αυτή προέκυψε βιβλιοθήκη ανασχεδιασμένων μορφών του ενζύμου και επιλέχθηκε μια μεταλλαγμένη μορφή για περεταίρω μελέτη. Η μεταλλαγμένη αυτή μορφή παρουσιάζει υψηλή συγγένεια ως προς το υπόστρωμα GSH. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μεταλλαξογένεση κορεσμού στη θέση Cys112 έτσι ώστε να δημιουργηθεί μια ανθεκτικότερη μορφή του ενζύμου σε οξειδωτικές συνθήκες. Από τη μελέτη επιλέχθηκε η μορφή Cys112Ser η οποία παρουσιάζει υψηλή συγγένεια για το GSH και παραμένει σταθερή από την επίδραση των οξειδωτικών παραγόντων Cu⁺² και Η₂Ο₂. Τέλος, μελετήθηκε η χρωματογραφική συμπεριφορά των παραπάνω μεταλλαγμένων μορφών και των άγριων τύπων του ενζύμου σε προσροφητή συγγένειας με ακινητοποιημένο GSH.