Investigation of the role of microglia and macrophages in remyelination and repair of the central nervous system, to enhance their beneficial function, as new therapeutic strategy for multiple sclerosis

Abstract

In demyelinating neurodegenerative disorders, including the autoimmune neuroinflammatory disease Multiple Sclerosis (MS), remyelination -the endogenous reparative process of the CNS- gradually fails, leading to irreversible neurological deficits. Microglia, the CNS-resident immune cells, play a critical role in both demyelination and remyelination by shaping the CNS environment. In this study pharmacological and conditional gene-targeting tools in mice, combined with single-cell and bulk brain transcriptomics, immunofluorescent 3D brain imaging, and functional motor performance tests, were applied in in vivo and in vitro experimental models of MS, to dissect the cellular and molecular mechanisms that regulate microglia-mediated CNS remyelination with the aim to identify potential therapeutic targets to enhance remyelination and CNS repair. Pharmacological inhibition of the major pro-inflammatory cytokine soluble TNF (solTNF) using XPro1595, a selective brain-penetrant inhibitor, promoted cortical remyelination and oligodendrocyte progenitor’s maturation in a Cuprizone-induced demyelination model, by modulating microglia responses. Restoration of myelin and associated clinical recovery were further validated in a second MS model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Additionally, spatial and temporal conditional gene editing using the tamoxifen-inducible Cx3cr1-CreER genetic system revealed that microglia-specific therapeutic deletion of TNF receptor 1 (TNFR1) the main receptor for solTNF, in contrast to TNFR2 the main receptor of transmembrane TNF, was sufficient to promote cortical remyelination and improve functional motor performance, demonstrating a beneficial cell-autonomous role of microglia in the absence of TNFR1. Phenotypic analysis of cortical microglia revealed an altered microglia polarization characterized by highly-activated morphology, beneficial Arginase-1 expression and enhanced interactions with neurons and astrocytes in the absence of the solTNF-TNFR1 axis, along with improved phagocytic clearance of myelin debris, a critical microglia function for OPC recruitment and remyelination. Furthermore, microglia ablation using the CSF1R inhibitor PLX3397 after the peak of Cuprizone-induced demyelination impaired myelin recovery, highlighting the essential contribution of microglia to CNS remyelination. Longitudinal brain RNA sequencing throughout disease progression and resolution revealed distinct brain transcriptomic signatures associated with demyelination and remyelination, with earlier recovery observed upon therapeutic microglia TNFR1 deletion. Single-cell transcriptomics of cortical microglia at disease onset revealed that disease-associated microglia (DAM) maintained an IL-10-reparative inflammatory phenotype instead of switching to a default IL-1-related damaging profile, in the absence of solTNF. The functional relevance of the identified molecular targets for microglia polarization was further validated in vivo. Microglia-specific genetic deletion of the IL-10 receptor (IL-10RA) in the Cuprizone-induced demyelination model, resulted in altered cortical microglial morphology at disease onset. Meanwhile, pharmacological blockade of the IL-1 receptor with Anakinra (IL-1Ra), an FDA-approved drug, reproduced the pro-remyelinating effects of microglia, observed with solTNF inhibition, in cortical Cuprizone-experimental demyelination. Disease-state microglia producing downstream IL-1/IL-18/CASP1 targets were identified in human MS and neuromyelitis optica (NMO) demyelinating lesions. Taken together, this study demonstrates that highly-activated inflammatory microglia mediate cortical remyelination in experimental Cuprizone-demyelination, and identifies solTNF-TNFR1 as an immune checkpoint for the polarization between reparative and damaging microglia inflammatory states. Cytokine reprogramming of microglia by selective inhibitors of solTNF, TNFR1, or downstream IL-1 pathways harnesses the beneficial properties of inflammatory microglia in favor of CNS restoration. Overall, redirecting disease microglia polarization and enhancing regenerative microglia functions is a potential therapeutic strategy for promoting remyelination in CNS demyelinating disorders.

Στις νευροεκφυλιστικές, απομυελινωτικές παθήσεις, όπως η Πολλαπλή Σκλήρυνση, η επαναμυελίνωση ως φυσιολογική διαδικασία επιδιόρθωσης του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) αποτυγχάνει σταδιακά, οδηγώντας σε μόνιμες νευρολογικές δυσλειτουργίες. Τα μικρογλοιακά κύτταρα διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο τόσο στην απομυελίνωση όσο και στην επαναμυελίνωση, διαμορφώνοντας το περιβάλλον του ΚΝΣ. Στην παρούσα έρευνα εφαρμόστηκε φαρμακολογική και γενετική στόχευση σε ποντίκια, σε συνδυασμό με τεχνικές μεταγραφωμικής ανάλυσης (single-cell και brain bulk RNA-seq), τρισδιάστατης απεικόνισης του εγκεφάλου με ανοσοφθορισμό και συμπεριφορικά τεστ, σε in vivo και in vitro πειραματικά μοντέλα της Πολλαπλής Σκλήρυνσης, με στόχο τη μελέτη των κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν τους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς της μικρογλοίας έναντι των νευροτοξικών, και την ταυτοποίηση πιθανών θεραπευτικών στόχων για την προώθηση της επαναμυελίνωσης και της επιδιόρθωσης του ΚΝΣ. Η φαρμακολογική αναστολή του διαλυτού TNF (solTNF), μιας κύριας προφλεγμονώδους κυτταροκίνης, μέσω του επιλεκτικού αναστολέα XPro1595, ενίσχυσε την επαναμυελίνωση του εγκεφαλικού φλοιού και προώθησε την ωρίμανση των πρόδρομων ολιγοδενδροκυττάρων στο μοντέλο Cuprizone-επαγόμενης απομυελίνωσης, μέσω της ρύθμισης των μικρογλοιακών αποκρίσεων. Η αποκατάσταση της μυελίνης και η κλινική βελτίωση επιβεβαιώθηκαν και στο μοντέλο της Πειραματικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλομυελίτιδας (EAE). Επιπλέον, η γενετική κυτταροειδική διαγραφή του TNFR1, του κύριου υποδοχέα του solTNF, στα μικρογλοιακά κύτταρα μέσω του tamoxifen-επαγόμενου Cx3cr1-CreER συστήματος, προήγαγε την επαναμυελίνωση του φλοιού και βελτίωσε τη κινητική λειτουργικότητα, αναδεικνύοντας τον ευεργετικό, αυτόνομο ρόλο των μικρογλοιακών κυττάρων απουσία του TNFR1. Περαιτέρω ανάλυση σε κυτταρικό επίπεδο αποκάλυψε την φαινοτυπική αλλαγή της μικρογλοίας έπειτα από φαρμακολογική και γενετική απαλοιφή του solTNF-TNFR1 σηματοδοτικού μονοπατιού, που χαρακτηρίζεται από έντονη ενεργοποιημένη μορφολογία, αυξημένη έκφραση της ευεργετικής Arginase-1 και από ενισχυμένες κυτταρικές αλληλεπιδράσεις με τους νευρώνες και τα αστροκύτταρα κατά την έναρξη της παθολογίας στον εγκεφαλικό φλοιό. Σε λειτουργικό επίπεδο, παρατηρήθηκε βελτιωμένη φαγοκυτταρική εκκαθάριση της κατεστραμμένης μυελίνης in vivo και in vitro, μια κρίσιμη λειτουργία της μικρογλοίας για την εκκαθάριση των απομυελινωτικών εστιών, την προσέλκυση προδρόμων ολιγοδενδροκυττάρων και την επαναμυελίνωση. Επίσης, η ολική απαλοιφή της μικρογλοίας μέσω του αναστολέα CSF1R, PLX3397, μετά την απομυελίνωση, ανέστειλε την επιτυχή αποκατάσταση της μυελίνης, υπογραμμίζοντας τον απαραίτητο ρόλο των μικρογλοιακών κυττάρων στην επαναμυελίνωση του ΚΝΣ. Σε μεταγραφικό επίπεδο, ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης ολόκληρου του εγκεφάλου (brain RNA-Sequencing), αποκάλυψε τις διακριτές γονιδιακές «υπογραφές» που σχετίζονται με την απομυελίνωση και την επαναμυελίνωση, με ταχύτερη ανάρρωση να παρατηρείται μετά από θεραπευτική διαγραφή του μικρογλοιακού TNFR1. Η μεταγραφωμική ανάλυση σε επίπεδο μεμονωμένου κυττάρου (single-cell RNA-Sequencing) του εγκεφαλικού φλοιού αποκάλυψε ότι εν απουσία του διαλυτού TNF, η ενεργοποιημένη μικρογλοία DAM διατηρεί ένα επιδιορθωτικό φλεγμονώδες προφίλ ελεγχόμενο από την έκφραση ιντερλευκίνης-10 (IL-10), εμποδίζοντας την ανάπτυξη ενός επιβλαβούς προφίλ που καθορίζεται από την ιντερλευκίνη-1 (IL-1). Η λειτουργική σημασία των νέων μοριακών στόχων για την διαφοροποίηση του φαινοτύπου της μικρογλοίας επιβεβαιώθηκε in vivo στο μοντέλο της Cuprizone-επαγόμενης απομυελίνωσης. Η γενετική κυτταροειδική διαγραφή του υποδοχέα της IL-10 (IL-10RA) στα μικρογλοιακά κύτταρα προκάλεσε αλλαγές στη μορφολογία και την ενεργοποίησή τους κατά την έναρξη της νόσου. Παράλληλα, η φαρμακολογική αναστολή του υποδοχέα IL-1 με την χορήγηση Anakinra (IL-1Ra), ένα εγκεκριμένο φάρμακο από τον FDA, αναπαρήγαγε τα επανορθωτικά αποτελέσματα της αναστολής του solTNF στην αποκατάσταση της μυελίνης και στην ενεργοποίηση της μικρογλοίας. Τέλος, η ιστοπαθολογική ανάλυση σε ανθρώπινους ιστούς ανέδειξε την ύπαρξη των IL-1/IL-18/CASP1 στη μικρογλοία σε απομυελινωτικές νόσους. Συνολικά, η παρούσα μελέτη παρουσιάζει στοιχεία ότι τα ενεργοποιημένα μικρογλοιακά κύτταρα διαμεσολαβούν την επαναμυελίνωση του εγκεφαλικού φλοιού στην πειραματική απομυελίνωση, και ταυτοποιεί το solTNF-TNFR1 μονοπάτι ως ένα ανοσολογικό σημείο ελέγχου για την μετάβαση μεταξύ ευεργετικών και νευροτοξικών μικρογλοιακών φαινοτύπων. Ο επαναπρογραμματισμός των φλεγμονωδών αποκρίσεων της μικρογλοίας μέσω της στόχευσης σημαντικών κυτταροκινών όπως ο solTNF, ο TNFR1 ή η IL-1 αξιοποιεί τις ιδιότητες της μικρογλοίας για την επιδίορθωση του ΚΝΣ. Η ενίσχυση των ευεργετικών επιδιορθωτικών μηχανισμών της μικρογλοίας αποτελεί μια πιθανή θεραπευτική στρατηγική για την προώθηση της επαναμυελίνωσης στις απομυελινωτικές νευροεκφυλιστικές νόσους.