Μεταλλαγές και έκφραση των ογκογονιδίων RAS και BRAF στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Abstract

Bladder cancer is the fifth most common malignancy in men in Western society. We determined RAS codon 12 and 13 point mutations and evaluated mRNA expression levels in transitional cell carcinoma cases. Mutational activation of the MAP kinase pathway is frequently found in many types of cancer. Recently, activating mutations in the BRAF gene, an important activator of this pathway, have been described in several tumor types including melanoma, colorectal and papillary thyroid cancer. The most frequent mutation in exon 15 (V600E) as well as several other mutations within exons 11 and 15 result in constitutive activation of the oncoprotein. Samples from 30 human bladder cancers and 30 normal tissues were analyzed by polymeRASe chain reaction/restriction fragment length polymorphism and direct sequencing to determine the occurrence of mutations in codons 12 and 13 of RAS family genes. Moreover, we used real-time reverse transcriptase-polymeRASe chain reaction to evaluate the expression profile of RAS genes in bladder cancer specimens compared to that in adjacent normal tissues. Furthermore, we investigated BRAF mutations in 30 human bladder tumors and their adjacent normal tissues. The V600E mutation was screened by PCR/RFLP and exons 11, 14 and 15 of BRAF including intron-exon boundaries were sequenced. Overall H-RAS mutations in codon 12 were observed in 9 tumor samples (30%). Two of the 9 patients (22%) had invasive bladder cancer and 7 (77%) had noninvasive bladder cancer. One H-RAS mutation (11%) was homozygous and the remaining 89% were heterozygous. All samples were WT for K and N-RAS oncogenes. Moreover, 23 of 30 samples (77%) showed over expression in at least 1 RAS family gene compared to adjacent normal tissue. K and N-RAS had the highest levels of over expression in bladder cancer specimens (50%), whereas 27% of transitional cell carcinomas demonstrated H-RAS over expression relative to paired normal tissues. We detected two tumor specimens bearing two different mutations, both of which were found in exon 15. One sample showed the T1799A (V600E) and the other the G1798T (V600L) mutation. The first specimen was stage pT1a and grade II, whereas the second was stage pT2b and grade III. No mutations within the coding region of exons 11, 14, 15 and the intron-exon junctions for the remaining samples were found. Our results underline the importance of H-RAS activation in human bladder cancer by codon 12 mutations. Moreover, they provide evidence that increased expression of all 3 RAS genes is a common event in bladder cancer that is associated with disease development. Furthermore, our results suggest that involvement of BRAF mutations in the development of transitional cell carcinoma of the bladder is infrequent.

Μεταλλάξεις στα μέλη της οικογένειας των γονιδίων RAS ανευρίσκονται σε μεγάλοαριθμό ανθρώπινων νεοπλασμάτων. Οι περισσότερες από αυτές αφορούν σημειακέςμεταλλάξεις στα κωδικόνια 12, 13 ή 61 που μετατρέπουν τα γονίδια RAS σε ογκογονίδια.Πρόσφατα ενεργείς μεταλλάξεις του γονιδίου BRAF, ενός σημαντικού διαμεσολαβητή της οδούRAS/RAF/MEK/ERK, περιγράφηκαν σε διάφορους όγκους συμπεριλαμβανομένων κακοήθουςμελανώματος, παχέος εντέρου και θηλώδους καρκίνου θυρεοειδούς. Η συχνότερη μετάλλαξηπου αφορά το εξόνιο 15 (V600E) καθώς και διάφορες άλλες στα εξόνια 11 και 15 οδηγούν σειδιοσυστατική ενεργοποίηση της ογκοπρωτεḯνης BRAF.Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η συχνότητα και η προγνωστική αξία τωνσημειακών μεταλλάξεων των γονιδίων της οικογένειας RAS σε άτομα με καρκίνο ουροδόχουκύστης. Δείγματα από ουροθηλιακό καρκίνο και φυσιολογικό ουροθήλιο 30 ασθενώνμελετήθηκαν με τις μεθόδους PCR/RFLP (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης/ανάλυσηπολυμορφισμού μεγέθους περιοριστικών θραυσμάτων) και Direct Sequencing (άμεσηαλληλούχιση) για την παρουσία μεταλλαγών των γονιδίων RAS στα κωδικόνια 12 και 13.Επιπλέον, με την τεχνική real time RT-PCR (αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδρασηπολυμεράσης σε πργματικό χρόνο) μελετήθηκε το επίπεδο έκφρασης των ογκογονιδίων RASστο επίπεδο του mRNA στον ουροθηλιακό καρκίνο και συγκρίθηκε με τα αντίστοιχα επίπεδαέκφρασης στο παρακείμενο φυσιολογικό ουροθήλιο. Στο δεύτερο σκέλος της παρούσαςδιατριβής διερευνήθηκε η συχνότητα των σημειακών μεταλλάξεων του γονιδίου BRAF σταδείγματα νεοπλασματικού και φυσιολογικού ουροθηλίου των παραπάνω ασθενών. Ημετάλλαξη V600E μελετήθηκε με τη μέθοδο PCR/RFLP και τα εξόνια 11, 14 και 15συμπεριλαμβανομένων των σημείων συνάντησης ιντρονίων/εξονίων υποβλήθηκαν σε άμεσηαλληλούχιση.Μεταλλάξεις του ογκογονιδίου H-RAS ανευρέθηκαν σε 9 ασθενείς (30%). Δύο από τους9 ασθενείς είχαν διηθητική νόσο (22%) και οι υπόλοιποι 7 (77%) επιφανειακή. Μία από τιςμεταλλάξεις ήταν ομόζυγη (11%) και οι υπόλοιπες (89%) ετερόζυγες. Σε κανένα δείγμα δενανιχνεύτηκαν μεταλλάξεις των ογκογονιδίων K και N-RAS (αγρίου τύπου). Yπερέκφραση σεένα τουλάχιστον μέλος της οικογένειας RAS παρατηρήθηκε στο 77% των δειγμάτων μεουροθηλιακό καρκίνο σε σύγκριση με τα παρακείμενα φυσιολογικά δείγματα. Τα υψηλότεραμεταγραφικά επίπεδα παρατηρήθηκαν στα Κ και N-RAS ογκογονίδια (50%) ενώ μόνο 27% τωνκαρκινικών ιστών έδειξαν υπερέκφραση του γονιδίου H-RAS συγκρινόμενοι με τουςαντίστοιχους φυσιολογικούς. Δεν διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύμεταλλάξεων και υπερέκφρασης των ογκογονιδίων RAS και κλινικοπαθολογικώνχαρακτηριστικών των όγκων. Δύο δείγματα έφεραν δύο διαφορετικές μεταλλάξεις στο εξόνιο15 του γονιδίου BRAF. Ενα δείγμα έφερε την μετάλλαξη V600E (νουκλεοτιδική αλλαγήT1799A) και το άλλο τη μετάλλαξη V600L (νουκλεοτιδική αλλαγή G1798T). Το πρώτο δείγμαήταν σταδίου pT1a και grade II ενώ το δεύτερο σταδίου pT2b και grade III. Καμμίαμεταλλαγή δεν ανευρέθηκε στα εξόνια 11, 14 και 15 καθώς και στα σημεία συνάντησηςιντρονίων/εξονίων των υπολοίπων δειγμάτων.Τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν την σημασία της ενεργοποίησης, διαμέσουμεταλλάξεων στο κωδικόνιο 12, του ογκογονιδίου H-RAS στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.Επίσης, παρέχουν αποδείξεις ότι η υπερέκφραση και των τριών γονιδίων RAS είναι ένα κοινόγεγονός στο ουροθηλιακό καρκίνο που σχετίζεται με την ανάπτυξη της νόσου. Τέλος,αποδεικνύεται ότι η συμμετοχή των BRAF μεταλλαγών είναι ασυνήθης στον καρκίνο τηςουροδόχου κύστης