Μεταβολές στη δομή και λειτουργία του κυτταρικού πυρήνα κατά τη διαδικασία της γήρανσης

Abstract

The cellular aging (senescence) is a permanent arrest of cell proliferation despite the presence of external mitogens in the culture medium. Induced either by a gradual reduction in telomere length with subsequent genomic instability, or after effect of stress factors such as the presence of oncogenes or oxidative stress, cellular senescence is essentially a well-accepted system of reference for comparison in the investigation of cell signaling pathways as well as in the study of functional changes in subcellular organelle especially in pathological conditions. In this context the present study by using senescence of human diploid fibroblasts as a reference system, we have investigated structural and biochemical changes in the cell nucleus associated with lamins and enzymes that modify them in the carboxyterminus and more specifically the endoprotease Rce1 and the methyltransferase Icmt. Looking in more detail the role of these enzymes in cell cycle progression, the dissertation led to findings that suggest a regulatory role for the methyltransferase in the middle of G1 phase of the cell cycle, with the functioning of the enzyme being a prerequisite for entry of the cell in S phase but also for the time required for its completion. Emerged alongside are new role of these enzymes in relation to the conduct and completion of cell division (mitosis), with inadequate presence of enzymes leading to lesions of the nuclear structure resulting in increased genomic instability and phenotypes resembling cellular senescence. The effect of enzymes on the verge of G2 / M is at least partly attributed to integrated processing of lamin B and we brought that carboxyl mutant protein unable to post-translational processing lead to concentration in intranuclear foci sequestering proteins necessary for proper mitotic progression as the centromeric protein Cenp-F and the phosphorylated form of histone 3, H3(ser10). The loss of progress or fidelity of the mitotic function peaks where the presence of these enzymes is defective in young cells, resulting in the failure of proper formation of mitotic spindle, leading the cell to senescent-like phenotype. Furthermore, we investigated the proper operation of the machinery for post-translational processing of type II transcripts (mRNAs) in senescence. We found poor processing of type II transcripts and this function is linked for the first time with the phosphorylated form of the ATR kinase at serine 428 and accumulation in RNA splicing speckles. This new role of ATR is also linked to the integrity of the nuclear lattice and the redistribution of p-ATR (ser 428) that we unveiled in senescent cells, also accompanied the misconfiguration of the nuclear envelope after downregulation of lamins with small interfering RNA in young cells.

Η κυτταρική γήρανση (senescence) συνιστά τη μόνιμη ανάσχεση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού παρά την παρουσία εξωτερικών μιτογόνων στο μέσο καλλιέργειας. Επαγώμενη είτε μέσω σταδιακής μείωσης του μήκους των τελομερών με ακόλουθη γενωμική αστάθεια, είτε μετά από επίδραση στρεσογόνων παραγόντων όπως παρουσία ογκογονιδίων ή οξειδωτικό στρες, η κυτταρική γήρανση συνιστά ουσιαστικά ένα εδραιωμένο σύστημα αναφοράς και σύγκρισης για τη διερεύνηση μονοπατιών κυτταρικής σηματοδότησης καθώς και μεταβολών που αφορούν στη λειτουργικότητα υποκυτταρικών οργανιδίων ιδιαίτερα σε παθολογικές καταστάσεις. Στο πλαίσιο αυτό η παρούσα διατριβή χρησιμοποιώντας την κυτταρική γήρανση ανθρώπινων διπλοειδών ινοβλαστών ως σύστημα αναφοράς, μελετά διεξοδικότερα δομικές και βιοχημικές αλλαγές στον πυρήνα του κυττάρου, σχετιζόμενες με τις λαμίνες καθώς και με τα ένζυμα που τις τροποποιούν στο καρβοξυτελικό τους άκρο και ιδιαίτερα την ενδοπρωτεάση Rce1 και τη μεθυλτρανσφεράση Icmt. Μελετώντας διεξοδικότερα το ρόλου των ενζύμων αυτών στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου η διατριβή οδηγήθηκε σε ευρήματα τα οποία υποδεικνύουν ρυθμιστικό ρόλο για τη μεθυλτρανσφεράση στο μέσο της φάσης G1, με τη λειτουργία του ενζύμου να συνιστά προϋπόθεση τόσο για την είσοδο του κυττάρου στη φάση S όσο και για το χρονικό διάστημα που απαιτείται για την περαίωσή της. Παράλληλα αναδείχθηκε νέος ρόλος των ενζύμων αναφορικά με την ορθή διεξαγωγή και ολοκλήρωση της κυτταρικής διαίρεσης (μίτωση), με πλημμελή παρουσία των ενζύμων να οδηγεί σε αλλοίωση της δομής του πυρήνα και σε φαινότυπους γενωμικής αστάθειας και κυτταρικής γήρανσης. Η επίδραση των ενζύμων στο μεταίχμιο G2/M οφείλεται τουλάχιστον εν μέρει στην ολοκληρωμένη επεξεργασία της λαμίνης Β, καθώς αναδείξαμε πως καρβοξυτελικά μεταλλάγματα της πρωτεΐνης με αδυναμία μεταμεταφραστικής επεξεργασίας οδηγούν σε συγκέντρωση σε ενδοπυρηνικές εστίες στις οποίες συσσωρεύονται πρωτεΐνες απαραίτητες για την ορθή διεξαγωγή της μιτωτικής προόδου όπως η πρωτεΐνη των κεντρομεριδίων Cenp-F καθώς και η φωσφορυλιωμένη μορφή της ιστόνης 3, H3(ser10). Η ανάσχεση προόδου ή η απώλεια πιστότητας της μιτωτικής λειτουργίας κορυφώνεται σε περιπτώσεις πλημμελούς παρουσίας των δύο ενζύμων σε νεαρά κύτταρα, με την αδυναμία ορθού σχηματισμού της μιτωτικής ατράκτου, οδηγώντας το κύτταρο σε γηρασμένο φαινότυπο. Περαιτέρω μελετήθηκε η ορθή λειτουργία της μηχανής μετα-μεταγραφικής επεξεργασίας των μεταγράφων τύπου ΙΙ (mRNAs) κατά τη γήρανση. Αναδείξαμε πλημμελή επεξεργασία των μεταγράφων τύπου ΙΙ διασυνδέοντας για πρώτη φορά τη λειτουργία αυτή με τη φωσφορυλιωμένη μορφή της κινάσης ATR στη σερίνη 428 και συσσώρευσή της στις εστίες εναλλακτικού ματίσματος. Ο νέος αυτός ρόλος της ATR συνδέεται επίσης με την ακεραιότητα του πυρηνικού πλέγματος καθώς η ανακατανομή της p-ATR(ser 428) που αναδείξαμε στα γηρασμένα κύτταρα, συνόδευε επίσης και την αλλοίωση της πυρηνικής λάμινας μετά από μεταρρύθμιση των λαμινών με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA σε νεαρά κύτταρα.