Διερεύνηση της οδού μεταγωγής σήματος του TGF-B σε αδενοκαρκινώματα στομάχου

Abstract

Background: Transforming growth factor-β (TGF-β) is a cytokine with a dual role in carcinogenesis. Its tumor suppressive role is believed to be accomplished mainly through the activation of Cyclin-Dependent Kinase Inhibitors, which act as cell cycle regulators. The pro-oncogenic effect of TGF-β is believed to be mediated through extracellular matrix production and the induction of angiogenesis and immunosuppression. Among the three recognized isoforms of TGF-β, TGF-β1 is the best studied and was found to be overexpressed in human cancer tissue. TGF-β1 signal transduction includes binding of the protein to a cell surface receptor which leads to intracellular signalling initiation, in which SMAD4 plays a pivotal role. Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor, p15 is one of the main targets of SMAD4 transcription complex, when the later one enters the nucleus. Objectives: The aim of this study was to investigate TGF-β1 pathway in human gastric carcinomas. The expression of TGF-β1, SMAD4 and p15 proteins was studied in a series of 63 gastric carcinomas, in relation with angiogenesis, clinicopathological parameters (gender, age, histologic type, histologic grade, tumor location, stage of disease) and patients survival. Materials and Methods: Specimens where obtained from 63 patients, operated for primary gastric cancer. The patients aged from 36 to 88 years (mean age 70 years). Patient’s mean survival time was19 months (range from 1 to 84 months). TGF-β1, SMAD4 and p15 expressions were investigated by means of immunohistochemistry (EnVision+ System-HRP) using monoclonal antibodies. Angiogenesis was also studied based on image analysis technique. Statistical analysis was performed using the SPSS10 statistical program. Results: TGF-β1 expression was detected in 25 (40%) of gastric carcinomas, while 30 (47.6%) cases presented preserved expression of SMAD4 and 18 cases were positive for p15 protein expression. In 7 cases, (11%) co-expression of the three proteins was observed. Expression of p15 protein was significantly associated with SMAD4 expression, (p=0.001). However, TGF-β1 expression was not found to be associated with SMAD4 (p=0.842) or p15 (p= 0.411) protein expression. Tumors with positive p15 expression were mostly seen in women (p=0.042), while p15 negative tumors were more frequently carcinomas of the intestinal type (p=0.036). Loss of p15 protein expression was associated with tumors located in the distal part of the stomach (p=0.041) and this was also the case for loss of SMAD4 protein expression (p=0.012). In the present study, microvessel density (MVD) ranged between 58-2153 vessels /mm2, with a mean of 444 vessels/mm2. MVD was strongly associated with TGF- β1 protein expression (Spearman’s test ρ=0.454, p<0.001), but not with the expression of the other two proteins (SMAD4 and p15). Survival statistical analysis at first demonstrated a trend for better survival (p=0.0645) in patients with TGF-β1 negative carcinomas. Survival analysis was repeated stratifying by stage of disease and this time a significant association between TGF-β1 expression and poor survival (p=0.0002) was demonstrated for stage IIIA patients. When survival analysis was stratified by the degree of tumor differentiation (good or moderate vs. poor), in the case of well or moderately differentiated tumors, survival was significantly better for patients with reduced SMAD4 expression (p=0.042). In conclusion, TGF-β1 expression does not seem to correlate with SMAD4 and p15 protein expression in human gastric carcinomas, suggesting a perturbation of TGF-β1 signalling pathway in this type of cancer. Moreover, the association between TGF-β1 expression and poor prognosis for stage IIIA patients, supports the pre-oncogenic role of TGF-β1 in carcinomas of the stomach. Induction of angiogenesis seems to contribute significantly to this role, as TGF-β1 expression was found to correlate strongly with microvessel density. On the other hand, the observed association between p15 and SMAD4 expression confirms their functional relation. Correlation of reduced SMAD4 expression with better patient’s survival in the case of well or moderately differentiated tumors, might suggest a, TGF-β1 independent, oncogenic effect of SMAD4 on gastric carcinogenesis.

O μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας β (Transforming Growth Factor –β, TGF-β) είναι μια κυτταροκίνη με διττή δράση στη καρκινογένεση. Η ογκοκατασταλτική του δράση υποστηρίζεται ότι επιτυγχάνεται εν πολύς μέσω της δράσης των αναστολέων των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών (Cyclin-Dependent Kinase, CDK), οι οποίοι αποτελούν ρυθμιστικά μόρια του κυτταρικού κύκλου. Αντίθετα η ογκογόνος δράση του TGF-β θεωρείται πως οφείλεται κυρίως στην ευόδωση της παραγωγής εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, στην επαγωγή της νεοαγγειογένεσης και στην καταστολή της ανοσιακής απάντησης του ξενιστή απέναντι στον όγκο. Από τις τρείς ισομορφές του TGF-β, καλύτερα μελετημένος είναι ο TGF-β1 ο οποίος έχει βρεθεί να υπερεκφράζεται σε καρκινώματα, ενώ σε φυσιολογικές συνθήκες δεν εκφράζεται σε επιθηλιακούς ιστούς. Η δράση του επιτυγχάνεται μέσω της πρόσδεσης του μορίου του σε ένα διαμεμβρανικό υποδοχέα, οπότε ενεργοποιείται η ενδοκυττάρια οδός μεταγωγής του σήματός του με μόριο-κλειδί τον παράγοντα SΜΑD4. Ο παράγοντας P15 είναι ένας από τους αναστολείς των CDKs και κύριως στόχος του μεταγραφικού συμπλόκου SMAD4 μετά την είσοδό του στον πυρήνα. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της οδού μεταγωγής του σήματος του TGF-β σε αδενοκαρκινώματα του στομάχου. Με βάση τα ως άνω δεδομένα, για το σκοπό αυτό επιλέχθηκε να μελετηθεί η έκφραση των πρωτεϊνών TGF-β1, SMAD4 και P15 σε αδενοκαρκινώματα στομάχου και η διερεύνηση της σχέσης της έκφρασης των μορίων αυτών αφ’ ενός μεταξύ τους και αφετέρου με την αγγειογένεση και με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους: φύλο, ηλικία, ιστολογικός τύπος, βαθμός διαφοροποίησης, εντόπιση, στάδιο της νόσου, όπως επίσης και με την επιβίωση των ασθενών. Το υλικό της παρούσης μελέτης αποτέλεσαν 63 πρωτοπαθή αδενοκαρκινώματα στομάχου προερχόμενα από ισάριθμους ασθενείς, ηλικίας 36 έως 88 ετών. Ο μέσος χρόνος επιβίωσης των ασθενών ήταν 19 μήνες. Η έκφραση των TGF-β1, SMAD4 και P15 μελετήθηκε σε τομές παραφίνης με την ανοσοϊστοχημική μέθοδο EnVision+ System-HRP και τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων. Επίσης έγινε διερεύνηση της νεοαγγειογένεσης χρησιμοποιώντας σύστημα ανάλυσης εικόνας και υπολογίζοντας την μικροαγγειακή πυκνότητα (MVD=αγγεία/mm2) σε κάθε περιστατικό. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με βάση το στατιστικό πακέτο SPSS10. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης, έκφραση του TGF-β1 ανιχνεύθηκε σε 25 (40%) καρκινώματα στομάχου, ενώ τα υπόλοιπα ήταν αρνητικά στην έκφραση της πρωτεϊνης. Επίσης το 47.6 % των καρκινωμάτων (30 περιπτώσεις) παρουσίασαν διατηρούμενη έκφραση του SMAD4, ενώ μειωμένη έκφραση παρουσίασε το 52.4% (33 περιπτώσεις). Θετική έκφραση έναντι του Ρ15 αναγνωρίστηκε στο 28.57% των περιπτώσεων (18 καρκινώματα) ενώ οι υπόλοιπες περιπτώσεις θεωρήθηκαν αρνητικές για την έκφραση του Ρ15. Σε 7 περιπτώσεις (11%) παρατηρήθηκε συνέκφραση των πρωτεϊνών P15, SMAD4 και TGF-β1. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων ανέδειξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των πρωτεϊνων P15 και SMAD4 (p=0.001), υπό την έννοια ότι 15 από τις 18 (83%) περιπτώσεις καρκινωμάτων με θετική έκφραση για Ρ15 εμφάνιζαν επίσης διατήρηση της έκφρασης της SMAD4 πρωτεϊνης. Αντίθετα η έκφραση της πρωτεϊνης TGF-β1 δε βρέθηκε να σχετίζεται στατιστικά σημαντικά με την έκφραση της πρωτεϊνης Ρ15 (p=0.411) ή της πρωτεϊνης SMAD4 (p=0.842). ....................