Γενετική και μοριακή μελέτη κληρονομικών και εκφυλιστικών παθήσεων του αμφιβληστροειδή χιτώνα

Abstract

Inherited retinal degenerations comprise a group of debilitating disorders of the retina that are highly heterogeneous both clinically and genetically and lead to ultimate loss of vision. The aim of this thesis is to investigate the genetic and molecular basis of diseases such as retinitis pigmentosa, cone-rod dystrophy and Stargardt disease in order to identify the causative gene(s) and the mutations that underlie each case investigated. Genetic mapping of a disease to a chromosomal location by linkage analysis is a prerequisite for successful positional cloning strategies. This method was applied for the genetic analysis of a greek family with the autosomal dominant form of retinitis pigmentosa. After exclusion of a number of candidate gene loci, linkage of the disease in this family was established to the RP13 locus on chromosome 17p13-12, to a genetic interval of 17 cM between microsatellite markers D17S849 and D17S1791. Thus far, the responsible gene for this type of disease is unknown. The genetic analysis of a second family of greek origin with the autosomal dominant form of cone-rod dystrophy implied linkage of the disease to the known locus CORD2 on chromosome 19ql3.3-13.4, to a genetic interval of 22 cM between markers D19S225 and D19S180. A gene, termed CRX (cone-rod homeobox), which was also mapped at the same interval was considered as a positional candidate for the disease. Indeed, mutation screening of the above family by direct sequencing revealed an A>C transition at nucleotide position 239 which causes a glutamine to alanine amino acid substitution at codon 80 (Glu80Ala) in affected individuals only. Expanding the mutation screening of CRX to 19 families of british and 10 families of greek origin that exhibit the same phenotype, as well as to 25 sporadic cases of greek origin, revealed a second transition of C>G at nucleotide position 28, which substitutes a histidine by aspartic acid at codon 10 (His10Asp) in one sporadic case, providing further evidence that this is the gene that underlies this disease. The autosomal recessive form of cone-rod dystrophy (arCRD) had not been previously studied owing to lack of families suitable for linkage analysis, and as a result there were no gene loci for arCRD at the time of this study. Genetic analysis of a greek pedigree with arCRD indicated that the disease is linked to the STGD1 locus on chromosome lp21-13, to an interval of 19 cM between markers D1S207 and D1S248. This locus co-localises with the genetic locus that underlies Stargardt disease. The ABCR gene (ATP-binding cassette transporter) which is expressed exclusively at the photoreceptors also maps to the same locus, and molecular analysis of this gene in a cohort of 70 patients with Stargardt disease, retinitis pigmentosa or cone-rod dystrophy revealed 21 novel mutations. Five patients with Stargardt disease carry the same mutation Gly863Ala in exon 17 of the ABCR gene as a result of a “founder effect”, supported by haplotype analysis of 63 cM around the gene. In order to identify novel genes expressed in the retina which could serve as potential candidates for some of the retinal degenerations, 30 cDNA clones were isolated from a human retina cDNA library. Twelve of these clones (40%) proved to be known genes and were eliminated from further study. One of the remaining clones, cDNA 607-j15 was further characterised because it mapped to the pericentric region of chromosome 8. Since one of the loci for the autosomal dominant form of retinitis pigmentosa also maps at the same location, cDNA 607-j15 was at first considered to be a potential candidate. However, this proved not to be the case as the causative gene for this disease was cloned and named RP1 (retinitis pigmentosa 1). This is the first attempt to investigate the genetic and molecular basis of inherited retinal degenerations in the greek population. The results confirm the vast clinical and genetic heterogeneity seen in this complex group of disorders and are the first steps towards the understanding of the disease mechanisms that underlie them.

Οι κληρονομικές και εκφυλιστικές παθήσεις του αμφιβληστροειδή χιτώνα του οφθαλμού αποτελούν ένα εξαιρετικά ετερογενές σύνολο παθήσεων τόσο όσον αφορά στην κλινική τους εικόνα όσο και στο γενετικό τους υπόβαθρο, με κοινή κατάληξη την απώλεια της όρασης. Σκοπός της διατριβής είναι να διερευνήσει τη γενετική και μοριακή βάση κληρονομικών αμφιβληστροειδοπαθειών όπως είναι η μελαγχρωστική αμφιβληστροειδοπάθεια, η δυστροφία των κωνίων-ραβδίων και η νόσος Stargardt, με τελικό στόχο την αναγνώριση του υπεύθυνου(ων) γονιδίου(ων) και της “παθογόνου” μεταλλαγής σε κάθε περίπτωση. Απαραίτητη προϋπόθεση για την επιτυχή εφαρμογή των στρατηγικών κλωνοποίησης γονιδίων είναι η γενετική χαρτογράφηση της κάθε ασθένειας κατόπιν μελέτης ανάλυσης γενετικής σύνδεσης. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε κατά τη γενετική ανάλυση μιας ελληνικής οικογένειας με αυτοσωμικό επικρατή τύπο μελαγχρωστικής αμφιβληστροειδοπάθειας και υπέδειξε σύνδεση της πάθησης με τη γενετική θέση RP13 στο χρωμόσωμα 17p13-12 μεταξύ των μικροδορυφορικών δεικτών DNA D17S849 και D17S1791 σε διάστημα 17 cΜ. Μέχρι στιγμής δεν έχει βρεθεί το υπεύθυνο γονίδιο γι’ αυτή την πάθηση. Η γενετική ανάλυση μιας δεύτερης οικογένειας ελληνικής καταγωγής με αυτοσωμικό επικρατή τύπο δυστροφίας των κωνίων-ραβδίων υπέδειξε σύνδεση της συγκεκριμένης πάθησης με τη γενετική θέση CORD2 στο χρωμόσωμα 19ql3.3-13.4 μεταξύ των δεικτών D19S225 και D19S180 σε διάστημα 22 cΜ. Στην ίδια χρωμοσωμική περιοχή χαρτογραφήθηκε και το γονίδιο CRX (cone-rod homeobox) το οποίο ήταν εξαίρετος υποψήφιος για την πάθηση. Η μελέτη της πρωτοδιάταξης του DNA σε έναν πάσχοντα από την παραπάνω οικογένεια αποκάλυψε μία μεταστροφή από αδενίνη σε κυτοσίνη στη νουκλεοτιδική θέση 239, μεταλλαγή που επιφέρει την αντικατάσταση ενός γλουταμινικού οξέος από αλανίνη στο κωδικόνιο 80 (Glu80Ala). Η μελέτη του γονιδίου CRX επεκτάθηκε σε δεκαεννέα οικογένειες βρετανικής και δέκα οικογένειες ελληνικής καταγωγής που παρουσιάζουν κλινική εικόνα δυστροφίας των κωνίων-ραβδίων, καθώς και σε εικοσιπέντε πάσχοντες ελληνικής καταγωγής που ανήκουν στις σποραδικές περιπτώσεις. Σε έναν από αυτούς τους πάσχοντες εμφανίστηκε μία μεταστροφή από κυτοσίνη σε γουανίνη στη νουκλεοτιδική θέση 28 που επιφέρει την αντικατάσταση ενός κατάλοιπου ιστιδίνης από ασπαρτικό οξύ στο κωδικόνιο 10 (His10Asp). Η πάθηση της δυστροφίας των κωνίων-ραβδίων που μεταβιβάζεται με τον αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο κληρονομικότητας δεν είχε μελετηθεί επαρκώς μέχρι τη στιγμή που άρχισε αυτή η διατριβή με αποτέλεσμα να μην υπάρχει γενετικός τόπος που να συνδέεται με την ασθένεια. Η μελέτη ανάλυσης σύνδεσης σε μία ελληνική οικογένεια έδειξε ότι υπεύθυνος για την πάθηση είναι ο γενετικός τόπος STGD1 στο χρωμόσωμα lp21-13, μεταξύ των δεικτών D1S207 και D1S248 σε διάστημα 19 cΜ. Ο συγκεκριμένος γενετικός τόπος συμπίπτει με το γενετικό τόπο που είναι υπεύθυνος για τη νόσο Stargardt. Στην ίδια χρωμοσωμική περιοχή (lp21-13) χαρτογραφείται και το γονίδιο ABCR (ATP-binding cassette transporter) που εκφράζεται αποκλειστικά στους φωτοϋποδοχείς. Μοριακή ανάλυση του γονιδίου ABCR σε σύνολο εβδομήντα ασθενών με νόσο Stargardt, μελαγχρωστική αμφιβληστροειδοπάθεια ή δυστροφία των κωνίων-ραβδίων υπολειπόμενου τύπου αποκάλυψε είκοσι μία νέες μεταλλαγές, στην πλειονότητά τους ανερμηνεύσιμες. Πέντε πάσχοντες με νόσο Stargardt φέρουν την ίδια μεταλλαγή (Gly863Ala) στο εξώνιο 17, γεγονός που οφείλεται στο φαινόμενο του “ιδρυτή” όπως έδειξε η ανάλυση απλοτύπων σε περιοχή 63 cM γύρω από το γονίδιο ABCR. Με στόχο το χαρακτηρισμό νέων γονιδίων που θα μπορούσαν να αποτελέσουν υποψήφιους θέσης για κάποιες μορφές αμφιβληστροειδοπαθειών, απομονώθηκαν τριάντα κλώνοι cDNA από βιβλιοθήκη αμφιβληστροειδή χιτώνα ανθρώπου. Δώδεκα κλώνοι (40%) εμφάνισαν ομολογία προς ήδη γνωστά γονίδια και δεν μελετήθηκαν περαιτέρω. Ένας από τους εναπομείναντες κλώνους, το cDNA 607-j15, χαρακτηρίστηκε περισσότερο διότι χαρτογραφήθηκε στην περιοχή του κεντρομεριδίου του χρωμοσώματος 8. Καθώς εκεί χαρτογραφείται και μία γενετική θέση υπεύθυνη για τη μελαγχρωστική αμφιβληστροειδοπάθεια αυτοσωμικού επικρατή τύπου, το cDNA 607-j15 θα μπορούσε να αποτελέσει υποψήφιο γονίδιο. Τελικά όμως, ένα άλλο γονίδιο το οποίο ονομάστηκε RP1 (retinitis pigmentosa 1) βρέθηκε υπεύθυνο γι’ αυτή την πάθηση. Η παρούσα μελέτη αποτελεί την πρώτη προσπάθεια διερεύνησης της γενετικής και μοριακής βάσης των κληρονομικών παθήσεων του αμφιβληστροειδή χιτώνα στην Ελλάδα. Τα αποτελέσματά της επιβεβαιώνουν τη μεγάλη κλινική και γενετική ετερογένεια που απαντάται σε αυτές τις παθήσεις και είναι το πρώτο βήμα για την κατανόηση των παθοφυσιολογικών μηχανισμών καθώς και των βιοχημικών μονοπατιών που ακολουθούνται.