Ετερογένεια σε στελέχη ζυμών saccharomyces cerevisiae ως προς τα γενοτυπικά, βιοχημικά, φυσιολογικά και τεχνολογικά τους χαρακτηριστικά

Abstract

The main object of the research was the study of endogenous microflora, and especially yeasts of genus Saccharomyces, during must spontaneous fermentations, from the varieties Xinomavro and Muscat Hamburg for the production of red and white wine. Totally, 110 yeast isolates were collected, at the beginning, in the middle and at the end of alcoholic fermentation, from which 84 isolates were identified as Saccharomyces cerevisiae. RAPD-PCR allowed species identification of the isolates and confirmed the results of phenotypic classification of S. cerevisiae strains. Method of mitochondrial DNA restriction fragment length polymorphism (mtDNA RFLP) was also applied and the high genetic heterogeneity revealed at intraspecies level indicates that the discrimination ability of mtDNA analysis was superior comparing to RAPD-PCR. Heterogeneity of technological characteristics was also studied concerning the following oenological criteria: the ability to produce hydrogen sulfide, low foaming ability, resistance to high total sulphur dioxide concentrations up to 300mg/L, growth and beginning of fermentation in the presence of ethanol up to 12%, ability to grow at high temperatures up to 42oC, sugar exhaustion ability, fermentation rate, resistance to killer yeasts toxins, glycerol and acetic acid production. Heterogeneity of biochemical characteristics of the tested strains was also studied. The following were examined: enzyme profile, production of biogenic amines, probiotic properties. The enzymes esterase, esterase/lipase, leucine aminopeptidase, valine aminopeptidase, cystine aminopeptidase, acid phοsphatase, α-glucosidase were detected in all tested strains. Phosphohydrolase activity was also exhibited and detected in all but strain BM10. Although each strain exhibited unique enzyme profile, the highest activity was detected for leucine aminopeptidase, acid phosphatase and α-glucosidase, while the mean activity of cystine aminopeptidase was considerably lower. Concerning probiotic properties of 27 S. cerevisiae strains, tolerance to high bile concentrations was evaluated. Results showed that an increase in biles concentration led to decrease of strain viability Concerning the effect of low pH, an average decrease 47% of viability was observed after one hour and 71,8% after four hours of incubation, at pH 3,0. There were strains with viability decrease over 90% (AM4, AM8, AT6) while other strains exhibited no significant decrease. In extreme acidic conditions (pH 1) the population decrease was very high (> 90%) and independent of incubation time and vinification type. Concerning the assimilation of cholesterol, highest assimilation ability was exhibited by strains BT7, BT1, AA3 and AT2 with a reduction of 16,7%, 15,9%, 15,7% and 14,5% respectively. Finally, concerning interactions with pathogenic bacteria, Yersinia enterocolitica was inhibited by strain AA4, Staphylococcus aureus was inhibited by strains AA4, AM9, AT6, VM3, VM5, VM10, Bacillus cereus was inhibited by strains AT6, VM1, VM7, Candida albigans was inhibited weakly by strains AT6, VM3, while against Escherichia coli there was not any inhibition action

Έναυσμα της έρευνας αποτέλεσε η μελέτη της ενδογενούς μικροχλωρίδας, με έμφαση στις ζύμες του γένους Saccharomyces, αυθόρμητων ζυμώσεων γλεύκους, από τις ποικιλίες Ξινόμαυρο και Μοσχάτο Αμβούργου για την παραγωγή ερυθρού και λευκού οίνου. Συνολικά απομονώθηκαν 110 στελέχη ζυμών, κατά την έναρξη τη μέση και το τέλος της αλκοολικής ζύμωσης, εκ των οποίων 84 στελέχη αναγνωρίστηκαν ως Saccharomyces cerevisiae. Η τεχνική τυχαιοποιημένου πολλαπλασιασμού πολυμορφικού DNA (RAPDPCR) επιβεβαιώνει την φαινοτυπική ταξινόμηση των απομονώσεων ως S. cerevisiae. Στη συνέχεια εφαρμόστηκε η τεχνική πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων από περιοριστικό ένζυμο του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA RFLP) και η μεγάλη γενετική ετερογένεια μεταξύ των ομαδοποιημένων στελεχών που αναδεικνύεται με την συγκεκριμένη τεχνική, υποδηλώνει ότι η διακριτική ικανότητα της ανάλυσης μιτοχονδριακού DNA σε επίπεδο στελέχους, είναι μεγαλύτερη συγκριτικά με την ανάλυση RAPD-PCR. Ακολούθως μελετήθηκε η ετερογένεια ως προς τις τεχνολογικές ιδιότητες όπως: ικανότητα παραγωγής υδρόθειου, χαμηλή ικανότητα αφρισμού, ικανότητα αντοχής έως 300mg/L ολικού διοξειδίου του θείου, ανάπτυξη και ικανότητα ζύμωσης σε συγκεντρώσεις έως 12% αιθανόλη, ανάπτυξη σε υψηλές θερμοκρασίες έως 42 ο C, ικανότητα να εξαντλούν τα υπάρχοντα σάκχαρα, εμφάνιση ικανοποιητικού ρυθμού ζύμωσης, εμφάνιση ανθεκτικού φαινότυπου σε φονικές ζύμες, ικανότητα παραγωγής γλυκερόλης και οξικού οξέος. Μελετήθηκε επίσης η ετερογένεια ως προς τα βιοχημικά χαρακτηριστικά: ενζυμική δραστηριότητα, παραγωγή βιογενών αμινών, προβιοτικές ιδιότητες. Τα ένζυμα εστεράση, εστεράση/λιπάση, αμινοπεπτιδάση λευκίνης, αμινοπεπτιδάση βαλίνης, αμινοπεπτιδάση κυστίνης, όξινη φωσφατάση και α-γλυκοσιδάση ανιχνεύτηκαν στο σύνολο των εξεταζόμενων στελεχών. Επίσης, δραστηριότητα φωσφοϋδρολάσης ανιχνεύτηκε σε όλα τα στελέχη εκτός από το ΒΜ10. Παρόλο ότι κάθε στέλεχος παρουσίαζε μοναδικό ενζυμικό προφίλ, η μέγιστη ενζυμική δράση αφορούσε την αμινοπεπτιδάση λευκίνης, την όξινη φωσφατάση και την αγλυκοσιδάση ενώ η μέση δραστηριότητα της αμινοπεπτιδάσης κυστίνης ήταν σημαντικά μικρότερη. Ως προς τις προβιοτικές ιδιότητες των 27 στελεχών S. cerevisiae, εκτιμήθηκε η ικανότητα αντοχής σε διάφορες συγκεντρώσεις χολικών αλάτων και βρέθηκε ότι με την αύξηση της συγκέντρωσης των χολικών αλάτων μειωνόταν η ικανότητα επιβίωσης των στελεχών. Ως προς την επίδραση του χαμηλού pH, κατά μέσο όρο παρατηρείται μείωση πληθυσμού κατά 47% σε μία ώρα και κατά 71,8% μετά από τέσσερις ώρες παραμονής σε pH 3,0. Επίσης υπάρχουν στελέχη των οποίων ο πληθυσμός μειώνεται κατά περισσότερο από 90% (ΑΜ4, ΑΜ8, ΑΤ6) ενώ σε άλλα η μείωση πληθυσμού που παρατηρείται είναι πολύ μικρή. Η μείωση του πληθυσμού σε ακραία όξινες συνθήκες (pH 1) είναι πολύ μεγάλη (>90%) και ανεξάρτητη από τη διάρκεια παραμονής και το είδος της οινοποίησης. Αναφορικά με την αφομοίωση χοληστερόλης, τη μέγιστη ικανότητα αφομοίωσης χοληστερόλης παρουσιάζουν τα στελέχη ΒΤ7, ΒΤ1, ΑΑ3 και ΑΤ2 με μείωση της ουσίας κατά 16,7%, 15,9%, 15,7% και 14,5% αντίστοιχα. Τέλος, αναφορικά με τις αλληλεπιδράσεις με παθογόνα βακτήρια, εναντίον της Yersinia enterocolitica δρα το στέλεχος ΑΑ4, ο Staphylococcus aureus αναχαιτίστηκε από τα στελέχη ΑΑ4, ΑΜ9, ΑΤ6, ΒΜ3, ΒΜ5, ΒΜ10, ο Bacillus cereus αναχαιτίστηκε από τα στελέχη ΑΤ6, ΒΜ1, ΒΜ7, η Candida albigans αναχαιτίστηκε ασθενώς από τα στελέχη ΑΤ6, ΒΜ3, ενώ εναντίον της Escherichia coli δεν εκδηλώθηκε κάποια αναχαιτιστική δράση