Μελέτη της απάντησης βιολογικού υλικού (Saccharomyces cerevisiae) στο stress μετά από επίδραση φαρμακολογικά δραστικών ουσιών

Abstract

The aim of the study was to investigate the cellular response to severe thermal stress (shock) in the monocellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae and to examine a number of regulatory factors and processes underlying the response. The wide use of S. cerevisiae as a reliable experimental model in biomedical research has been primarily based on the cellular functions sharing significant homology between yeast and higher organisms. Research in the field of the highly conserved response to stress stimuli that modify the physiological homeostasis is currently focused on the investigation of physiological, biochemical, cellular and molecular adaptive mechanisms.This study investigated the role of the external environment in the heat shock response in yeast and the involvement of pH, de novo protein synthesis, ionic homeostasis and phosphorylation, as well as the protective and adaptive responses following treatment with drugs interacting with HSP90 and nucleic acids. The pharmacologically active agents were administered to post-log phase growing yeast cultures (27°C, 22h), which were (pretreated) or were not (control) exposed to mild thermal stress (37°C, 2h), with or without subsequent exposure to heat shock (HS, 53°C, 30min).The results demonstrated that the cell free supernatant of the resistant pretreated cultures increased the survival of control cells, in a de novo protein synthesis-dependent way, independently of pHe or Ca2+e. Inhibition of H+ATPase by omeprazole, prior or during the HS, induced dose-dependent thermotolerance in control cultures, while blockade of K+-channels by tetraethylammonium ions resulted in thermotolerance only upon addition of the agent during the HS. Incubation with amiodarone resulted in a dose-dependent toxic effect, while mepivacaine produced no alteration. The PP2A phosphatase inhibitor okadaic acid induced a biphasic toxic action in control cultures. Following non-selective phosphatase inhibition by molybdate, the cell free supernatant of the resulting thermo tolerant non-pretreated cultures protected control cells during the HS, in contrast to that derived from cultures exhibiting tolerance after incubation with the HSP90 inhibitor geldanamycin or the antimetabolite 5-fluorouracil.These findings led to the conclusion that modifications in the incubation medium during exposure to mild thermal stress determined, independently of pHe, the protective potential of the external microenvironment in favor of the yeast populations that had not been prepared to survive under shock. Both the generation of protective signals under mild stress and the acquisition of protection under severe shock were dependent on de novo protein synthesis. Finally, the role of H+ and K+ homeostasis was decisive for survival under severe heat shock, while the results were indicative for the implication of the PP2A phosphatases and genomic events during the adaptive response. The possible involvement of the latter was deduced from the observed induction of thermotolerance upon exposure to pharmacological agents that may directly or indirectly interact with nuclear components, without the manifestation of accompanying protective characteristics by the external environment.

Σκοπός της διατριβής ήταν η μελέτη της απάντησης των κυττάρων του μονοκυττάριου ευκαρυωτικού οργανισμού Saccharomyces cerevisiae στο ισχυρό θερμικό stress (shock) και η διερεύνηση υποκείμενων ρυθμιστικών παραγόντων και διαδικασιών. Ο S. cerevisiae χρησιμοποιείται ευρέως ως πειραματικό πρότυπο στη βιοϊατρική έρευνα, με αξιόπιστα αποτελέσματα, λόγω των ομόλογων με τους ανώτερους οργανισμούς κυτταρικών λειτουργιών. Η μελέτη του εξελικτικώς συντηρητικού φαινομένου της απάντησης των οργανισμών σε στρεσσογόνα ερεθίσματα που μεταβάλλουν τη φυσιολογική ομοιόσταση επικεντρώνεται σήμερα στη διερεύνηση φυσιολογικών, βιοχημικών, κυτταρικών και μοριακών προσαρμοστικών μηχανισμών.Στη διατριβή διερευνήθηκε ο ρόλος του εξωτερικού περιβάλλοντος κατά την απάντηση στο stress στο σακχαρομύκητα και η συμμετοχή του pH, της de novo πρωτεϊνοσύνθεσης, της ιοντικής ομοιόστασης και της φωσφορυλίωσης καθώς και η προστατευτική και προσαρμοστική απάντηση μετά από επίδραση φαρμάκων που αλληλεπιδρούν με τη HSP90 και τα πυρηνικά οξέα. Οι δραστικές ουσίες χορηγήθηκαν σε υγρές καλλιέργειες της μεταλογαριθμικής φάσης ανάπτυξης (27°C, 22h) του μύκητα, χωρίς (μάρτυρες) ή μετά από έκθεση σε ήπιο θερμικό stress (37°C, 2h, προθερμασμένα κύτταρα), πριν ή κατά την ακόλουθη έκθεση σε θερμικό shock (HS, 53°C, 30min).Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ελεύθερο κυττάρων υπερκείμενο των ανθεκτικών προθερμασμένων καλλιεργειών αύξησε την επιβίωση των μαρτύρων, με τη συμμετοχή της de novo πρωτεϊνοσύνθεσης, αλλά χωρίς τη συμμετοχή του pHe και του Ca2+e. Η αναστολή της Η+ΑΤΡάσης από την ομεπραζόλη πριν ή κατά το HS προσέδωσε δοσοεξαρτώμενη ανθεκτικότητα στους μάρτυρες, ενώ η αναστολή των διαύλων Κ+ από τα ιόντα τετρααιθυλαμμωνίου οδήγησε σε θερμοανθεκτικότητα μόνο κατά το HS. Η αμιοδαρόνη έδειξε δοσοεξαρτώμενη τοξική επίδραση, ενώ η μεπιβακάίνη δε μετέβαλε την απάντηση. Ο αναστολέας των ΡΡ2Α φωσφατασών οκαδαϊκό οξύ εμφάνισε διφασική τοξική δράση στους μάρτυρες. Κατά τη μη εκλεκτική αναστολή των φωσφατασών από το μολυβδαίνιο, το ελεύθερο κυττάρων υπερκείμενο των ανθεκτικών μη προθερμασμένων καλλιεργειών άσκησε προστατευτική επίδραση στους μάρτυρες κατά το HS, σε αντίθεση με το προερχόμενο από ανθεκτικούς πληθυσμούς μετά από επίδραση του αναστολέα της HSP90 γελνταναμυκίνη ή του αντιμεταβολίτη 5-φθοριουρακίλη.Τα ευρήματα αυτά οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι, οι όποιες μεταβολές στο υλικό καλλιέργειας κατά την έκθεση του σακχαρομύκητα σε ήπιο θερμικό stress καθόρισαν, ανεξάρτητα από το pHe, την προστατευτική ικανότητα του εξωκυττάριου μικροπεριβάλλοντος προς όφελος των πληθυσμών που δεν είχαν προετοιμαστεί για να επιβιώσουν υπό συνθήκες ισχυρού shock. Τόσο η παραγωγή προστατευτικών σημάτων κατά το ήπιο θερμικό stress, όσο και η αποδοχή της προστατευτικής επίδρασης υπό συνθήκες ισχυρού shock ήταν εξαρτώμενη από τη de novo πρωτεϊνοσύνθεση. Τέλος, η ομοιόσταση των Η+ και Κ+ έπαιξε αποφασιστικό ρόλο στην επιβίωση κατά το HS, ενώ κατά στην προσαρμοστική απάντηση πιθανώς να εμπλέκονται οι φωσφατάσες ΡΡ2Α, καθώς και γενωμικά γεγονότα, αφού κατά το φαρμακολογικό stress με ουσίες που δρούν άμεσα ή έμμεσα στον πυρήνα παρατηρήθηκε θερμοαντοχή, χωρίς επαγωγή των προστατευτικών ιδιοτήτων του εξωτερικού περιβάλλοντος.