Aνάπτυξη μεθοδολογίας αέριας χρωματογραφίας - φασματομετρία μάζας (GC-MS) για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό στεροειδών ορμονών στον ορό: εφαρμογή στην διάγνωση ενδοκρινοπαθειών

Abstract

O προσδιορισμός των στεροειδών ορμονών χρησιμοποιείται ευρέως στην κλινική πρακτική για την διερεύνηση και διάγνωση διαφόρων ενδοκρινικών νοσημάτων. Ο ακριβής προσδιορισμός της συγκέντρωσης των στεροειδών στον ορό, στο πλάσμα ή στα ούρα είναι πολύ σημαντικός για την διάγνωση και θεραπευτική αγωγή των ασθενών. Η μέτρηση των στεροειδών στην καθημερινή ρουτίνα διεκπεραιώνεται, ως επί το πλείστον, με την τεχνική των ανοσοαναλύσεων. Η διεθνής όμως βιβλιογραφία υποστηρίζει ότι οι ανοσοαναλύσεις οδηγούν συχνά σε εσφαλμένως υψηλά αποτελέσματα, γεγονός που δημιουργεί προβλήματα στην διάγνωση. Στην παρούσα μελέτη περιγράφεται η ανάπτυξη και η αξιολόγηση μιας νέας μεθοδολογίας αέριας χρωματογραφίας-φασματομετρίας μαζών (GC-MS) για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό της 17ΟΗπρογεστερόνης (17ΟΗΡ), της τεστοστερόνης (Τ) της δευδροεπιανδροστερόνης (DHEA), της ανδροστενεδιόνης (Δ4-Α), της κορτιζόλης (F) και της πρεγνενολόνης (Preg) στον ορό 26 νεογνών και 64 παιδιών. Ο προσδιορισμό των στεροειδών ορμονών στον ορό με GC-MS περιλαμβάνει τα εξής στάδια : · Απομόνωση των στεροειδών από τον ορό (500μL) με εκχύλιση, χρησιμοποιώντας οργανικό διαλύτη (αιθέρα). · Τα εκχυλιζόμενα στεροειδή υφίστανται παραγωγοποίηση με MSTFA/TMSI/DTE πριν την χρωματογραφική ανάλυση. · Εισαγωγή του παραγωγοποιημένου δείγματος στεροειδών στον αναλυτή. Για την αξιολόγηση του ποσοτικού προσδιορισμού των στεροειδών, εκτιμήθηκαν η ειδικότητα της μεθόδου, το όριο ανίχνευσης, το όριο ποσοτικοποίησης, η γραμμικότητα, η ακρίβεια και η ορθότητα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μέθοδος έχει υψηλή ειδικότητα στο σύνολο των στεροειδών που εξετάστηκαν. Το όριο ανίχνευσης είναι χαμηλότερο από 0.1 ng/mL. Το όριο ποσοτικοποίησης είναι 0.1 ng/mL για όλα τα στεροειδή εκτός από την κορτιζόλη (0.25 ng/mL). Η ορθότητα για όλα τα στεροειδή στις συγκεντρώσεις 0.5, 1, 5 και 10 ng/mL (n=10) κυμαίνεται από 0.8% έως 16.6%. Η ακρίβεια της μεθόδου υπολογίστηκε στις συγκεντρώσεις 0.5, 1, 5 και 10 ng/mL κι έχει εύρος τιμών από -9.2 % έως 10.6% (n=10). Καμπύλες αναφοράς κατασκευάστηκαν για τα πέντε στεροειδή (0.125-31.25ng/mL) και για την κορτιζόλη (0.125-200 ng/mL) με συντελεστή συσχέτισης R2? 0.99. Η σχετική ανάκτηση υπολογίστηκε στις συγκεντρώσεις 1.0 και 12.5 ng/mL και κυμαίνεται από 70.5 έως 97.5%. Η απόλυτη ανάκτηση υπολογίστηκε στις ίδιες συγκεντρώσεις και κυμαίνεται από 73.2 έως 96.6%. Με την παρούσα μέθοδο υπολογίστηκαν τα όρια αναφοράς κατά ηλικία για νεογνά ηλικίας από 9 έως 40 ημερών καθώς και για παιδιά ηλικίας από 3 έως 16 ετών (με στάδιο εφηβείας προσδιορισμού κατά Tanner). Συμπερασματικά στην παρούσα μελέτη αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος GC-MS για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό έξι στεροειδών με υψηλή ειδικότητα, και εξαιρετική ακρίβεια και ευαισθησία. Η νέα αυτή μέθοδος είναι απλή και συνεπώς ενδείκνυται και ως μέθοδο ρουτίνας για την διερεύνηση/διάγνωση της συγγενούς υπερπλασίας των επινεφριδίων, του συνδρόμου των πολυκυστικών ωοθηκών, της υπογονιμότητας, καθώς και στην παρακολούθηση θεραπείας καταστολής των ανδρογόνων.