Ανάπτυξη μεθόδου δεσμευτικής αναλύσεως για την ανίχνευση-προσδιορισμό βιομορίων σε βιολογικά δείγματα: ανίχνευση μεταλλάξεων του γονιδίου BRCA1 με μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων και βιοαισθητήρα

Abstract

In the context of this thesis a sensitive and rapid method characterized by high discrimination efficiency was developed for the simultaneous detection of BRCA1 tumour suppressor gene mutations 3099delT, R1751X, 5382insC, G1738R, 5586G>A, R1203X and 3741insA using the solid phase hybridization technique combined with oligonucleotide (ONT) microarrays and biosensor. The above mentioned mutations were selected since they cover the 67% of whole point mutations (substitutions, insertions and deletions) found in Greek families with breast or/and ovarian cancer history. To achieve this goal, a new method was developed for the immobilization of ONT on solid supports. This method was based on the binding of pre-formed conjugates of biotinylated ONT (b-ONT) with streptavidin on the solid support coated with b-BSA. Using the developed method, microarrays fabricated through the deposition of microspots presented higher surface density, hybridization efficiency and sensitivity (detection limit 6 x 10-11) than microarrays prepared according to literature protocols, based on the binding of b-ONT either on streptavidin adsorbed on the solid support (detection limit 2.31 x 10-10) or on streptavidin immobilized on a b-BSA layer (detection limit 1.07 x 10-10). Moreover, appropriate primers were designed and cycler protocols were developed for the polymerase chain reaction in order to amplify specific BRCA1 gene sequences that correspond to the selected mutations. For the simultaneous detection of the BRCA1 mutations when microarrays were prepared according to the literature, based on the immobilization of common length b-ONT, it was found that it was not possible to achieve efficient discrimination between the wild and mutant sequences even after optimization of the hybridization and washing parameters. To address this issue, the length of the recognition b-ONT was optimized for each mutation individually (3099delT: 24bs, R1751X: 14bs, 5382insC: 16bs, G1738R: 16bs, 5586G>A: 17bs, R1203X: 16bs and 3741insA: 17bs). Thus, when hybridization with a mixture of fluorescently labeled synthetic ONT was performed, the ratios of wild/wild to wild/mutant signals achieved ranged from 7 to 47. These figures are much higher than the discrimination ratios, ranging from 1 to 8, reported in the literature for the simultaneous detection of BRCA1 gene mutations. Using the optimized conditions, analysis of all mutations was performed in DNA samples from 9 healthy individuals and three patients. For the healthy individuals, the ratios of wild/wild to wild/mutant signals determined for all the mutations ranged from 6 to 100. For the patients, respective values were observed for all of the examined sequences apart from one for each sample (5382insC, G1738R και 3741insA), where the ratios of wild/wild to wild/mutant signals ranged from 0.96 to 1.10 indicating these patients were eterozygous carriers of the respective mutations. These findings correlate well with the results obtained from direct DNA sequencing method both for the samples of the healthy donors and the samples of the patients, demonstrating the high discrimination efficiency and the reliability of the developed method regarding the detection of the selected mutations of the BRCA1 gene. The developed method for the detection of mutations using microarrays was applied, upon further optimization, to an optoelectronic biosensor consisted of an array of nine integrated monolithic silicon transducers combined with a microfluidic module for the application of the reagents onto the surface of the optocouplers. Hybridization of fluorescently labeled oligonucleotides to the immobilized ones modulated the coupling efficiency between the light emitting diode and the detector generating the analytical signal. A detection limit of 0.9 nM (9 fmol) was achieved using the AlexaFluor® 647 dye as label. For the detection of mutations 3099delT, R1751X and 5382insC, ONT corresponding to wild-type and mutant sequences were immobilized on different optocouplers and hybridized with fluorescently labeled ONT that were complementary to the wild-type of the gene. Using the optical biosensor hybridization and de-hybridization during washing steps were monitored in real time permiting the accomplishment of kinetic measurements. It was found that the kinetic measurements obtained using the optical biosensor provided 3-8 times higher ratios of wild/wild to wild/mutant signals than those determined with end-point measurements obtained using microarrays under the same hybridization and washing temperatures. Therefore, it is expected that the use of biosensors could provide considerably higher discrimination efficiency between wild and mutant sequences than microarrays. The bioanalytical capabilities of the biosensor along with the potential for the incorporation of highly dense transducer arrays on a single chip open new frontiers regarding the fabrication of microsystems appropriate for point-of-care analysis.

Στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη ευαίσθητης, ταχείας και με υψηλή διακριτική ικανότητα μεθόδου για την ταυτόχρονη ανίχνευση των μεταλλάξεων 3099delT, R1751X, 5382insC, G1738R, 5586G>A, R1203X και 3741insA του ογκοκατασταλτικού γονιδίου BRCA1 μέσω υβριδισμού στερεάς φάσης με μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων (ΟΝΤ) και βιοαισθητήρα. Η επιλογή των παραπάνω μεταλλάξεων βασίστηκε στο γεγονός ότι οι μεταλλάξεις αυτές καλύπτουν το 67% του συνόλου των σημειακών μεταλλάξεων (αντικαταστάσεις, απαλειφές και ενθέσεις) του γονιδίου BRCA1 σε Ελληνικές οικογένειες με υψηλό κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου μαστού ή/και ωοθηκών. Στα πλαίσια της ερευνητικής εργασίας για την επίτευξη των παραπάνω πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη νέας μεθόδου ακινητοποίησης ΟΝΤ σε στερεές επιφάνειες που περιελάμβανε πρόσδεση συζευγμάτων στρεπταβιδίνης με βιοτινυλιωμένα ΟΝΤ (β-ΟΝΤ) σε επιφάνεια στην οποία είχε προσροφηθεί βιοτινυλιωμένη αλβουμίνη ορού βοός (β-BSA). Με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε κατασκευάστηκαν μικροσυστοιχίες με εναπόθεση μικροκηλίδων οι οποίες παρουσίασαν υψηλότερη επιφανειακή πυκνότητα, ικανότητα υβριδισμού των ακινητοποιημένων ΟΝΤ και ευαισθησία (όριο ανίχνευσης 6 x 10-11 Μ) σε σύγκριση με μικροσυστοιχίες που προέκυψαν βάσει πρωτοκόλλων της βιβλιογραφίας τα οποία περιελάμβαναν είτε πρόσδεση β-ΟΝΤ σε επιφάνεια που φέρει στρεπταβιδίνη ακινητοποιημένη άμεσα στο στερεό (όριο ανίχνευσης 2,31 10-9 Μ) είτε σε στρεπταβιδίνη ακινητοποιημένη μέσω στοιβάδας β-BSA (όριο ανίχνευσης 1,07 10-9 Μ). Επιπλέον, για την ενίσχυση ειδικών αλληλουχιών του γονιδίου BRCA1 στις οποίες εντοπίζονταν οι εξεταζόμενες μεταλλάξεις πραγματοποιήθηκε σχεδιασμός κατάλληλων εκκινητών και ανάπτυξη πρωτοκόλλων στο θερμοκυκλοποιητή για την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης. Για την ταυτόχρονη ανίχνευση των μεταλλάξεων του γονιδίου, όταν χρησιμοποιήθηκαν συστοιχίες οι οποίες είχαν προκύψει από ακινητοποίηση αναγνωριστικών β-ΟΝΤ κοινού μήκους, όπως προτείνεται στην πλειοψηφία των μεθόδων της βιβλιογραφίας, βρέθηκε ότι δεν ήταν δυνατή η αξιόπιστη διάκριση μεταξύ φυσιολογικών και μεταλλαγμένων αλληλουχιών ακόμα και μετά από τη βελτιστοποίηση των παραμέτρων υβριδισμού και εκπλύσεων. Για το λόγο αυτό βελτιστοποιήθηκε το μήκος των β-ΟΝΤ ακινητοποίησης για κάθε μία μετάλλαξη (3099delT: 24bs, R1751X: 14bs, 5382insC: 16bs, G1738R: 16bs, 5586G>A: 17bs, R1203X: 16bs και 3741insA: 17bs). Με αυτόν τον τρόπο επιτεύχθηκαν λόγοι ειδικού (φυσιολογικό/φυσιολογικό) προς μη ειδικό (φυσιολογικό/μεταλλαγμένο) σήμα υβριδισμού, κατά την ανίχνευση σε μίγμα φθορισμοεπισημασμένων συνθετικών ΟΝΤ, οι οποίοι κυμαίνονταν από 7 έως 47. Οι παραπάνω τιμές των λόγων είναι πολύ υψηλότερες από αυτές που αναφέρονται σε δημοσιευμένη μελέτη στην οποία οι λόγοι διαχωρισμού που ελήφθησαν κατά τον ταυτόχρονο προσδιορισμό μεταλλάξεων του γονιδίου BRCA1 κυμαίνονταν από 1 έως 8. Χρησιμοποιώντας τις βέλτιστες συνθήκες της δεσμευτικής αντίδρασης πραγματοποιήθηκε ανάλυση για όλες τις μεταλλάξεις σε δείγματα εννέα φυσιολογικών ατόμων και τριών ασθενών. ...............................................................................................................................................