Επίδραση της ωκυτοκίνης στην in vivo και in vitro ανάπτυξη εμβρύων μυών, και η έκφραση του υποδοχέα της κατά την περίοδο της εμφύτευσης του προ-εμβρύου στη μήτρα

Abstract

Oxytocin (OT) is a small peptide hormone mainly produced by the paraventricular and the supraoptic nuclei of the hypothalamus as a large prepropeptide, which is subjected to cleavage to the active hormone and its carrier molecule neurophysin. Oxytocin acts through its receptor (OTR) and plays an important role in a variety of physiological processes, with those related to various reproductive functions being the most studied. Expression of OT has also been detected in many other organs such as uterus, ovaries, corpus luteum, testis, gastrointestinal tract and heart. Furthermore, it has been recently documented that OT is able to induce the differentiation of mouse embryonic stem cells and regulate the proliferation of cancer cells, in vitro. The hormone binds to its receptor, activating phospholipase C-β to induce the generation of inositol trisphosphate and 1,2-diacylglycerol. The most acknowledged site of OT action and OTR expression is the uterus. Although, the OT/OTR system of the mammalian uterus has mainly been studied in relation to its involvement in the onset of labor, OT and its receptor seem to be dynamically regulated during estrus and early pregnancy, implying further physiological roles in other reproductive functions, too. The receptor has been detected to be expressed in low amounts in the monkey, horse and human endometrium. Both the receptor and its mRNA have been reported to be down-regulated during the pre- and post-implantation period of the reproductive cycle in all studied mammals. In addition, OTR has been reported to be down-regulated in the human myometrium and endometrium during ovulation and early pregnancy. The receptor is mainly expressed in the endometrial glands of the epithelium. The down-regulation of OTR by interferon-r (a blastocyst product) in endometrial cells in vitro implies a role for OT and the regulation of its receptor’s expression during embryonic implantation. The proximate aim of the present study was to analyze the in vivo and in vitro expression and localization pattern of OTR in the mouse endometrium, the blastocyst and the implanting embryo, in order to shed light into the importance of OT in specific aspects of reproduction, particularly blastocyst implantation and early embryonic development. In addition, the effects of OT and its antagonist atosiban (in the form of Tractocile®, a drug used for preterm labour) in the in vitro development of mouse embryos were investigated. The above were also studied in mouse embryonic stem cells. In order to study the in vivo expression of OTR in the mouse endometrium, 5- to 8-week-old female mice [New Zealand Black (NZB) x New Zealand White (NZW)] were sacrificed at various days of their reproductive cycle for five days, after the appropriate control of the cycle with ovulation induction regiments. Similarly, uteri were obtained from impregnated female mice. The tissues were fixed in formalin, embedded in paraffin and the expression of OTR was detected immunohistochemically. In addition, fertilized oocytes were collected from 5- to 8-week-old female mice with established copulation (vaginal plug) and were cultured in Ham’s F-10 medium in the presence of OT (10⁻⁴ - 10⁻⁷ Μ) or the well-established OT antagonist atosiban (10⁻⁴ - 10⁻⁷ Μ). The expression of OTR mRNA was studied by RT-PCR, while embryonic development was monitored twice daily and the embryos were graded according to blastocyst stage. The immunohistochemical detection of OTR revealed the expression of the receptor in the mouse endometrium, mainly in the epithelial cells of the endometrial glands of the uterus, throughout its reproductive cycle. A down-regulation of the receptor was observed during ovulation and the peri-implantation period of the cycle. In 5- to 6-days pregnant mice immunohistochemistry revealed the presence of the receptor mainly in the epithelial cells of the endometrial glands of the uterus and the embryonic cells of the attaching embryo, but not at the endometrial cells surrounding the attaching embryo. On the contrary, during embryonic invasion and early placental development the expression of OTR was up-regulated. In 5-days cultured embryos, both blastocyst development and blastocyst quality were not affected by the administration of exogenous OT, as revealed by photon microscopy (p>0.05). On the other hand, high concentrations of atosiban (10⁻⁴ Μ) inhibited embryo development at the 4-cell stage completely, while the arrested embryos did not degenerate (n>200). Similarly, lower concentrations of the antagonist (10⁻⁵ M) led to a blastocyst formation rate of about 40% (p<0.01 compared to the control). Furthermore, according to the WHO guidelines, the quality of the blastocysts in both cases did not differ from the control. The oxytocin receptor was mRNA was detected by RT-PCR in mouse blastocysts. Embryonic apposition appeared to be accompanied by a controlled down-regulation of OTR specifically at the implantation site, as the receptor continued to be expressed at the endometrial glands. This process seems to be part of the physiological reproductive cycle in the mouse, although there are reports of OTR down-regulation mechanisms controlled by the embryo itself (interferon-τ). Our observations verify the expression of OTR and its mRNA in the mouse blastocyst, while OT appears to be an important factor of cell proliferation and its action is necessary for early mouse embryonic development.

Η ωκυτοκίνη είναι μια μικρή, πεπτιδική ορμόνη, το προπεπτίδιο της οποίας συντίθεται κυρίως στα γιγαντοκύτταρα των νευρώνων του παρακοιλιακού και του υπεροπτικού πυρήνα του υποθαλάμου. Η σύνθεση της ωκυτοκίνης σε μικρότερες συγκεντρώσεις έχει επιβεβαιωθεί και σε άλλα όργανα και ιστούς, όπως είναι η μήτρα, οι ωοθήκες, το ωχρό σωμάτιο, οι όρχεις, η καρδιά, κ.α. Δρα μέσω του υποδοχέα της (OTR) και συμμετέχει, ως ένα βαθμό, σε πλήθος αναπαραγωγικών διαδικασιών, εκ των οποίων η σύσπαση των λειών μυών της μήτρας κατά τον τοκετό και η διέγερση της διαδικασίας του θηλασμού είναι αυτές που έχουν περισσότερο μελετηθεί και κατανοηθεί. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες διαπιστώνουν τη συμμετοχή του συστήματος OT/OTR στη διαφοροποίηση εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων (πλειοδύναμα κύτταρα της εσωτερικής μάζας της βλαστοκύστης) ποντικού in vitro, καθώς και την πιθανή εμπλοκή του στη διαφοροποίηση και στον πολλαπλασιασμό διαφόρων τύπων κυττάρων. Στα πλαίσια αυτής της μελέτης διερευνήθηκε η επίδραση της ωκυτοκίνης στην in vitro ανάπτυξη προ-εμβρύων ποντικού, καθώς και η παρουσία του υποδοχέα της τόσο σε προ-έμβρυα όσο και σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα ποντικού. Πέραν τούτου, παρόλο που η δράση της ωκυτοκίνης έχει μελετηθεί εκτενώς στο μυομήτριο κατά τον τοκετό, η ενδεχόμενη σύνθεση της ορμόνης και του υποδοχέα της στο ενδομήτριο κατά τη διάρκεια του αναπαραγωγικού κύκλου, καθώς και οι ρόλοι τους, παραμένουν αρκετά ασαφείς. Για αυτό τον λόγο, διερευνήθηκε η έκφραση του υποδοχέα της ωκυτοκίνης στο ενδομήτριο του ποντικού κατά τη διάρκεια των πρώτων σταδίων της κύησης, με έμφαση στο «παράθυρο» της εμφύτευσης του προ-εμβρύου στη μήτρα. Προς συμπλήρωση των παραπάνω, μελετήθηκε ταυτόχρονα η παρουσία της ωκυτοκίνης καθώς και ενός εκ των ρυθμιστών της έκφρασης του γονιδίου του υποδοχέα, της ιντερλευκίνης-6 (IL-6). Προκειμένου να διαπιστωθεί η επίδραση της ωκυτοκίνης στην ανάπτυξη του προ-εμβρύου του ποντικού ελήφθησαν γονιμοποιημένα ωάρια από ποντίκια και καλλιεργήθηκαν παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων ωκυτοκίνης (10⁻⁴ - 10⁻⁷ Μ), αφού πριν είχε επιβεβαιωθεί η έκφραση του mRNA για τον υποδοχέα σε διάφορα στάδια της ανάπτυξής του (ώριμο ωάριο, ζυγωτό, προ-έμβρυο σταδίου ανάπτυξης των 4-κυττάρων, μορίδιο και βλαστοκύστη) με την εφαρμογή της μεθόδου της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής αλυσιδωτής πολυμεράσης (RT-PCR). Σε καλλιεργημένα προ-έμβρυα παρουσία ωκυτοκίνης, τόσο το ποσοστό ανάπτυξης βλαστοκύστης όσο και η ποιότητα αυτής φάνηκαν να μην επηρεάζονται από την παρουσία της ορμόνης (p>0.05). Εντούτοις, με τη χρήση της RT-PCR και της μεθόδου της ανοσοστύπωσης (Western Blot) επιβεβαιώθηκε η έκφραση του mRNA για την ωκυτοκίνη και η σύνθεση της ορμόνης από τα αναπτυσσόμενα προ-έμβρυα κατά τη διάρκεια της in vitro καλλιέργειάς τους, με αποτέλεσμα να κριθεί απαραίτητη η χρησιμοποίηση του ανταγωνιστή της ωκυτοκίνης atosiban προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της στέρησης της ορμόνης στο προ-έμβρυο του ποντικού κατά την in vitro ανάπτυξή του. Κατά την καλλιέργεια γονιμοποιημένων ωαρίων παρουσία του ανταγωνιστή της ωκυτοκίνης, παρατηρήθηκε στην υψηλότερη συγκέντρωση του atosiban (10⁻⁴ Μ) διακοπή της ανάπτυξης των προ-εμβρύων στα τέσσερα κύτταρα σε όλα τα καλλιεργηθέντα έμβρυα, χωρίς όμως να υπάρξει εκφυλισμός τους (n>200 έμβρυα). Επιπλέον, κατά την καλλιέργεια παρουσία 10⁻⁵ Μ του ανταγωνιστή μόλις το 45% των προ-εμβρύων αναπτύχθηκε έως το στάδιο της βλαστοκύστης (p<0.01 σε σχέση με την ομάδα ελέγχου). Οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις του ανταγωνιστή δεν φάνηκαν να επηρεάζουν την ανάπτυξη των γονιμοποιημένων ωαρίων στο στάδιο της βλαστοκύστης. Τέλος, η ανάπτυξη προ-εμβρύων που είχαν προηγούμενα αναπτυχθεί in vitro έως το στάδιο των 4-κυττάρων υπό φυσιολογικές συνθήκες καλλιέργειας, χωρίς την παρουσία της ορμόνης ή του ανταγωνιστή της, διεκόπη στο αναπτυξιακό στάδιο των 6-8 κυττάρων. Από τα παραπάνω αποτελέσματα προκύπτει η πιθανή συμμετοχή της ωκυτοκίνης στις διαδικασίες ανάπτυξης του προ-εμβρύου, και κυρίως στον πολλαπλασιασμό των βλαστομεριδίων του. Με το συμπέρασμα αυτό συγκλίνουν και μελέτες επί εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων και καρκινικών κυτταρικών σειρών ποντικού, στις οποίες περιγράφεται η ρυθμιστική δράση της ωκυτοκίνης στη διαφοροποίηση και πολλαπλασιασμό τους, αντίστοιχα. Προς αυτή την κατεύθυνση επιβεβαιώθηκε στα πλαίσια αυτής της μελέτης και η συνεχής έκφραση του υποδοχέα της ωκυτοκίνης σε «εμβρυοειδή σωμάτια» που σχηματίστηκαν κατά την καλλιέργεια εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων ποντικού. Η μήτρα αποτελεί μια από τις πιο σημαντικές θέσεις δράσης αλλά και έκφρασης της ωκυτοκίνης και του υποδοχέα της. Έως σήμερα έχει ανιχνευθεί ο υποδοχέας της ωκυτοκίνης στο ενδομήτριο του πιθήκου, του επίμυ και του ανθρώπου, σε αρκετά χαμηλές συγκεντρώσεις. Έχει παρατηρηθεί μείωση της συγκέντρωσης του υποδοχέα στο μυομήτριο και ενδομήτριο των γυναικών κατά τη μέση του αναπαραγωγικού κύκλου και τα πρώτα στάδια της κύησης. Ο υποδοχέας ανιχνεύεται κυρίως στα επιθηλιακά κύτταρα των ενδομητριακών αδενίων, με ελάχιστη έως καθόλου ύπαρξή του στο στρώμα. Όμοιο πρότυπο έκφρασης του υποδοχέα της ωκυτοκίνης στο ενδομήτριο κατά τη διάρκεια του αναπαραγωγικού κύκλου καταγράφεται και στον ποντικό κατά τη διάρκεια αυτής της μελέτης. Για τη διερεύνηση της σύνθεσης του υποδοχέα της ωκυτοκίνης στο ενδομήτριο της μήτρας κατά τη διάρκεια των πρώτων σταδίων της κύησης (εμφύτευση του προ-εμβρύου) ελήφθησαν μήτρες εγκύων ποντικών [New Zealand Black (ΝΖΒ) x New Zealand White (NZW)] κατά τις περιόδους της 4ης - 5ης ημέρας της κύησης (εμβρυϊκή επαφή με το ενδομήτριο και απόθεση) και 7ης – 8ης ημέρας της κύησης (διείσδυση του προ-εμβρύου στη μήτρα). Οι ιστοί υπέστησαν ιστολογική διαδικασία παραφίνωσης και μελετήθηκε η σύνθεση του υποδοχέα της ωκυτοκίνης και η παρουσία της ωκυτοκίνης και της ιντερλευκίνης με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Κατά τη φάση της εμβρυϊκής εναπόθεσης στο ενδομήτριο, ο υποδοχέας της ωκυτοκίνης ανιχνεύθηκε κυρίως στα επιθηλιακά κύτταρα των ενδομητριακών αδενίων, ενώ δεν παρατηρήθηκε η παρουσία του στο αδενικό επιθήλιο του αυλού της μήτρας και στα ενδομητριακά κύτταρα που περιέβαλαν το προ-έμβρυο. Επιπλέον, ανιχνεύθηκε ανοσοϊστοχημικά η παρουσία της ωκυτοκίνης και της ιντερλευκίνης-6 στο ενδομήτριο, με ελάχιστη έως καθόλου παρουσία τους στο μυομήτριο. Αντίθετα, κατά τη διαδικασία της διείσδυσης του προ-εμβρύου παρατηρήθηκε η σύνθεση του υποδοχέα της ωκυτοκίνης τόσο στα κύτταρα του προ-εμβρύου, όσο και στα κύτταρα της τροφοβλάστης και σε κάποια από τα κύτταρα του ενδομήτριου που περιέβαλαν το εμφυτευόμενο προ-έμβρυο. Η ωκυτοκίνη και η ιντερλευκίνη-6 κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης της εμφυτευτικής διαδικασίας ανιχνεύθηκαν στο ενδομήτριο αλλά και στο μυομήτριο της μήτρας, με ιδιαίτερα αυξημένη παρουσία της ωκυτοκίνης περιφερειακά του προ-εμβρύου και στον φθαρτό του ενδομήτριου. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, η αναστολή της συσταλτικότητας της μήτρας πιθανόν να αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την επιτυχή περάτωση της φάσης της εναπόθεσης του προ-εμβρύου, ενώ το αντίθετο φαίνεται να ισχύει κατά τη διείσδυση του προ-εμβρύου. Βάση των παραπάνω, το πρότυπο αυτό δραστηριότητας της μήτρας φαίνεται να συμφωνεί με το πρότυπο έκφρασης της ωκυτοκίνης και του υποδοχέα της που περιγράφεται από τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης. Ο ρόλος της ωκυτοκίνης όμως στη μήτρα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της εμφύτευσης πιθανόν να μην περιορίζεται μόνο στον έλεγχο της συσταλτικότητάς της. Η αποδεδειγμένη δράση του συστήματος OT-OTR στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση πιθανόν να εξηγεί την έκφραση του υποδοχέα της ωκυτοκίνης και τη συσσώρευση της ορμόνης που παρατηρήθηκαν στην παρούσα μελέτη στις περι-εμφυτευτικές περιοχές του ενδομήτριου και στην τροφοβλάστη κατά τη διείσδυση του προ-εμβρύου, μια διαδικασία στην οποία τα κύρια γεγονότα αποτελούν ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση της τροφοβλάστης και η ρύθμιση της ανάπτυξης του πλακούντα.