Μελέτη των γονιδίων ρύθμισης της απόπτωσης και του κυτταρικού κύκλου σε μυεολοδυσπλαστικά σύνδρομα

Abstract

Myelodysplastic syndromes (MDS) constitute a heterogeneous group of clonal haematopoietic disorders that exhibit ineffective haematopoiesis with an increased risk of transformation to acute myeloid leukaemia (AML). A delicate balance exists between accelerated programmed cell death (apoptosis) and proliferation (cell cycle) of the leukemic haematopoietic stem cell that permits many patients to survive for years. When the balance shifts toward proliferation of the leukemic clone, AML develops, with a poor outcome for most but not all patients. Ιn the last few years τhere have been a large number of studies that examine alterations of the expression of numerous genes in the diverse types of MDS. Taking these into consideration, the aim of the present study was to identify molecular alterations in the bone marrow of adult patients with de novo MDS, more precisely to detect alterations of cell cycle regulatory genes, particularly CDK1, CDK2, CDK3, CDK4, p27, p21, PISSLRE, p16, cyclins A, B, C, D1, D2, D3, A1 and of apoptosis regulatory genes, particularly caspases 1,2,3,5,6,7,8,9, Granzyme B, bclxL, bclxS, bfl1, bik, bak, bax, bcl2, mcl1. Moreover our study included estimation of apoptosis in the bone marrow of patients using the Annexin V affinity assay, as well as analysis of cell cycle and calculation of cells in the S phase with the use of flow cytometry. The median value of apoptosis for all MDS cases was 2,79% (range 0.34-9). A positive correlation was found between caspases 3, 2L, 2S, 9, CDKs 1, 2 and 4, as well as p21 expression and the level of apoptosis. The median value of S phase of the cell cycle was 10,6% (range 0,19-27,4). A positive correlation was found between caspase 3 expression levels and S phase. Patients of the IPSS ?1 score group were associated with higher values of mcl1 gene expression. Cases with bone marrow blasts ?5% showed higher bclw, mcl1 and bfl1 gene expression values. Regarding FAB classification we divided the patients’ population into three subgroups: RA and RARS, RAEB and RAEBT and CMML. CMML correlated with higher cyclin D1 gene expression. Cyclin D2, bclxL, bax and mcl1 gene median values were found higher in patients with MDS, compared to normal donors. On the contrary CDK3, p21 and caspase 7 gene median values were lower in patients compared to healthy individuals. To our knowledge this is the first study that examines mRNA expression of numerous apoptosis and cell cycle control genes simultaneously in MDS patients. The statistical analysis of the results revealed correlation of specific genes with the IPSS score, with the degree of apoptosis, as well as with specific clinical features of patients. Moreover the expression of seven specific genes appeared to differ between patients and healthy individuals. Last, higher expression of cyclin D1 correlated with the CMML subtype. Taking into consideration the multifactorial pathogenetic features of MDS, as well as the therapeutic dilemmas that often occur, we consider the developing understanding of apoptosis and cell cycle function essential, with the view to proceed to molecularly targeted treatment and improved clinical outcome.

Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) αποτελούν ετερογενή ομάδα κακοηθών νοσημάτων του αιμοποιητικού ιστού, τα οποία οφείλονται σε κλωνική διαταραχή του αρχέγονου πολυδύναμου αιμοποιητικού κυττάρου. Πολυάριθμες είναι οι μελέτες που εξετάζουν τη συμμετοχή διαταραχών έκφρασης μεμονωμένων γονιδίων σε διάφορες υποκατηγορίες ΜΔΣ. Η σύγχρονη ανίχνευση διαταραχών έκφρασης διαφόρων ομάδων γονιδίων θα επιτρέψει πιθανότατα την εξαγωγή ασφαλέστερων συμπερασμάτων σχετικά με την παθογένεια και προγνωστική αξιολόγηση των ΜΔΣ. Με βάση τα παραπάνω δεδομένα μελετήσαμε τα επίπεδα της έκφρασης γονιδίων που συμμετέχουν στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε ασθενείς με νεοδιαγνωσθέν ΜΔΣ. Ειδικότερα τα γονίδια που μελετήθηκαν είναι τα ακόλουθα: CDK1, CDK2, CDK3, CDK4, p21, p27, p16, PISSLRE, κυκλίνες A, B, C, D1, D2, D3, A1, κασπάσες 1,2S, 2L,3,5,6,7,8,9, Granzyme B, bclxL, bclxS, bfl1, bik, bak, bax, bcl2, mcl1. Η μελέτη μας περιέλαβε επιπλέον κυτταρομετρική προσέγγιση της απόπτωσης των κυττάρων του μυελού με τη μέθοδο της αννεξίνης καθώς επίσης και ανάλυση του κυτταρικού κύκλου και μέτρηση της S-φάσης με κυτταρομετρία ροής. Η διάμεση τιμή της απόπτωσης για όλους τους ασθενείς βρέθηκε να είναι 2,79 (με εύρος 0,34-9). Θετική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων και των επιπέδων των κασπασών 3, 2L, 2S, 9, των επιπέδων των CDKs 1, 2 και 4, όπως επίσης και του p21. Η διάμεση τιμή της S φάσης βρέθηκε να είναι 10,6% (με εύρος 0,19-27,4). Η μόνη συσχέτιση της S φάσης με κάποιο από τα γονίδια ήταν η θετική συσχέτιση με τις τιμές της κασπάσης 3. Παρατηρήθηκαν υψηλότερες τιμές του γονιδίου mcl1 στην ομάδα ασθενών με IPSS ?1. Επίσης καταγράφηκαν οι ακόλουθες συσχετίσεις: υψηλότερες τιμές των γονιδίων bclw, mcl1 και bfl1 στην ομάδα με βλάστες μυελού των οστών ?5%. Σχετικά με τη FAB ταξινόμηση έγινε ένας διαχωρισμός σε τρεις ομάδες: RA και RARS, RAEB και RAEBT και CMML και εξετάστηκε η έκφραση κάθε γονιδίου ξεχωριστά στις τρεις αυτές κατηγορίες. Η έκφραση του γονιδίου της κυκλίνης D1 ήταν υψηλότερη σε στατιστικά σημαντικό βαθμό στην ομάδα CMML. Η διάμεση τιμή της κυκλίνης D2 και των γονιδίων bclxL, bax και mcl1 βρέθηκε να είναι αυξημένη σε στατιστικά σημαντικό βαθμό στην ομάδα των ασθενών. Αντίθετα οι διάμεσες τιμές των γονιδίων CDK3, p21 και Caspase 7 βρέθηκαν μειωμένες στην ομάδα των ασθενών. Από όσο είμαστε σε θέση να γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη στη βιβλιογραφία που εξετάζει την έκφραση σε επίπεδο mRNA πολλαπλών γονιδίων της απόπτωσης και του κυτταρικού κύκλου ταυτόχρονα. Από τη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων προκύπτει συσχέτιση συγκεκριμένων γονιδίων με το IPSS, με την απόπτωση των κυττάρων του μυελού, καθώς και με συγκεκριμένα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Επιπλέον καθορίζονται γονίδια που διαφοροποιούν τους ασθενείς με ΜΔΣ από τους υγιείς και τέλος ανιχνεύεται υψηλότερη έκφραση της κυκλίνης D1 στην υποκατηγορία CMML. Περαιτέρω διερεύνηση των κυτταρικών οδών της απόπτωσης και του κυτταρικού κύκλου είναι απαραίτητη.