Συγκριτική μελέτη της έκφρασης των φλεγμονωδών κυτταροκινών στον ορό, στο κυτταρόπλασμα και σε επίπεδο αγγελιοφόρου RNA σε παιδιά με ατοπία

Abstract

Atopic diseases (atopic bronchial asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis), are reactions of hypersensitivity type I. Their pathophysiology requires the participation and cooperation of several organs, cells and mediators (as cytokines), resulting in chronic inflammatory disorder. Over the last years, extensive studies indicate that there is an imbalance between Th1 and Th2 lymphocytes in atopic diseases with predominance of the Th2 type immune response. This imbalance is caused by genetic and environmental factors coming together. The aim of the present study was the determination and correlation of cytokine levels IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 and IFN-γ in three different levels of expression: mRNA, cytoplasmic protein of the cells and soluble protein of the serum in order to define the sensitivity and specificity of the methods that were used. The study included 178 children of which, 97 presented one or more atopy symptoms, 44 had respiratory system infection (the time of blood samples collection) and 37 were healthy. Children with atopy symptoms were separated into 2 subgroups, A1 and A2.Those of A1 subgroup had elevated serum IgE (>2SD) for their age, positive result to at least one allergy test (RAST Tests) and clinical symptoms of atopy. Those of A2 had elevated serum IgE (>2SD) for their age, negative allergy tests and mild clinical symptoms of atopy. Group B consisted of children with respiratory system infection and Group C of healthy children. Intracellular expression of cytokines at CD4+ T-lymphocytes was examined by flow cytometry. Serum cytokine levels were measured by enzyme-linked immunoassays (ELISA method). The same method was used for the semiquantitive measurement of mRNA levels of cytokines IL10 and IFN-γ. The results of the present study for intracellular expression, serum cytokine levels and mRNA levels, showed that Th2 type cytokines IL-4, IL-5 and IL-10 are elevated in atopic children (subgroup A1) in comparison to healthy control group ( statistically significant difference). Th1 type cytokines IL-12 and IFN-γ were elevated in children with infection in comparison to atopic (subgroups A1 and A2) and healthy children (with not always statistically significant difference). So, this study indicates a predominance of Th2 against Th1 immune response to atopic diseases in agreement with international literature. The method with the highest sensitivity and specificity was the flow cytometric determination of intracellular cytokine expression followed by the ELISA method and the semiquantitive determination of cytokine mRNA levels. However, there are also other criteria to be considered before we choose the most appropriate and proposed cytokine measurement method, as the financial cost, the chronic duration of every method and the required laboratory equipment for its application.

Τα ατοπικά νοσήματα (ατοπικό βρογχικό άσθμα, αλλεργική ρινίτιδα, ατοπική δερματίτιδα), αποτελούν αντιδράσεις υπερευαισθησίας τύπου Ι του οργανισμού. Στην παθοφυσιολογία τους εμπλέκονται πλήθος οργάνων, κυττάρων και μεσολαβητών (όπως οι κυτταροκίνες), με αποτέλεσμα την παρουσία μιας χρόνιας φλεγμονώδους διαταραχής. Τα τελευταία χρόνια, εκτεταμένες μελέτες υποδεικνύουν ότι στα ατοπικά νοσήματα υπάρχει διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ των Th1 και Th2 λεμφοκυττάρων, με επικράτηση της ανοσιακής απάντησης των Th2. Η διαταραχή αυτή αποδίδεται στην αλληλεπίδραση γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση και συσχέτιση των επιπέδων των κυτταροκινών ιντερλευκίνης 4 (IL-4), ιντερλευκίνης 5 (IL-5), ιντερλευκίνης 10 (IL –10), ιντερλευκίνης 12 (IL-12) και ιντερφερόνης-γ (IFN-γ), σε 3 διαφορετικά επίπεδα έκφρασης : αγγελιοφόρου RNA (mRNA), πρωτεΐνης στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων και ελεύθερης πρωτεΐνης στον ορό, προκειμένου να καθοριστεί η ευαισθησία και η ειδικότητα των εργαστηριακών μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν. Η μελέτη περιέλαβε 178 παιδιά, εκ των οποίων τα 97 παρουσίαζαν από ένα έως περισσότερα συμπτώματα ατοπίας, τα 44 είχαν λοίμωξη του αναπνευστικού συστήματος κατά την αιμοληψία και τα 37 ήταν υγιή. Τα παιδιά με συμπτώματα ατοπίας (ομάδα Α) χωρίσθηκαν σε δύο υποομάδες, Α1 και Α2. Τα παιδιά της υποομάδας Α1, είχαν αυξημένη τιμή IgE (>2SD) για την ηλικία τους, θετικό αποτέλεσμα σε μία ή περισσότερες δοκιμασίες αλλεργίας (RAST Tests) και κλινική εικόνα ατοπίας. Τα παιδιά της υποομάδας Α2, είχαν αυξημένη τιμή IgE (>2SD) για την ηλικία τους, αρνητικές τις δοκιμασίες αλλεργίας (RAST Tests) και ήπια κλινική εικόνα ατοπίας. Τα παιδιά με λοίμωξη του αναπνευστικού συστήματος αποτέλεσαν την ομάδα Β και τα υγιή παιδιά την ομάδα ελέγχου Γ. Η μελέτη της ενδοκυττάριας έκφρασης των κυτταροκινών έγινε με την εφαρμογή της κυτταρομετρίας ροής. Η μέτρηση των επιπέδων των κυτταροκινών στον ορό έγινε με τη μέθοδο ELISA χρησιμοποιώντας έτοιμα kit του εμπορίου, και η ημιποσοτική μέτρηση των επιπέδων του mRNA των κυτταροκινών, έγινε επίσης με τη μέθοδο ELISA με kit του εμπορίου βάσει των οδηγιών της κατασκευάστριας εταιρίας. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης όσον αφορά τις ενδοκυττάριες μετρήσεις, τις μετρήσεις στον ορό και τις μετρήσεις σε επίπεδο mRNA, δείχνουν ότι οι κυτταροκίνες της Th2 ανοσιακής απάντησης, IL4, IL-5 και IL-10 επικρατούν στην ομάδα Α1 των ατοπικών παιδιών σε σχέση με την υγιή ομάδα ελέγχου (οι διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές). Οι κυτταροκίνες της Th1 ανοσιακής απάντησης, IL-12 και IFN-γ, ήταν αυξημένες στην ομάδα των παιδιών με λοίμωξη, σε σχέση τόσο με τα ατοπικά παιδιά (Α1 και Α2 ομάδας) όσο και με τα υγιή παιδιά, με διαφορές που δεν ήταν πάντα στατιστικά σημαντικές Η παρούσα μελέτη λοιπόν, υποδεικνύει μια σαφή επικράτηση της Th2 έναντι της Th1 ανοσιακής απάντησης στα ατοπικά νοσήματα, συμφωνώντας με τη διεθνή βιβλιογραφία. Η μέθοδος με την υψηλότερη ευαισθησία και ειδικότητα ήταν η μέτρηση της ενδοκυττάριας έκφρασης των κυτταροκινών με την κυτταρομετρία ροής. Ακολουθούν η μέθοδος ELISA και η ημιποσοτική μέτρηση των επιπέδων του mRNA των κυτταροκινών. Ωστόσο υπάρχουν και άλλα κριτήρια προκειμένου να επιλεχθεί η καταλληλότερη και προτεινόμενη μέθοδος μέτρησης των κυτταροκινών, όπως το οικονομικό κόστος, η χρονική διάρκεια της κάθε μεθόδου καθώς και ο εργαστηριακός εξοπλισμός που απαιτείται για την εφαρμογή της.