Καρκίνος του παχέος εντέρου: βιοχημική και ανοσοϊστοχημική μελέτη

Abstract

Biochemical study of human solid tumours of the large intestine has been limited, untilrecently. This thesis presents data from the analysis of cytoplasmic polypeptides derived frommalignant and non- malignant tissues of large intestine, utilising the method of 2-dimensionalelectrophoresis. This technique has been proved to be highly sensitive, and has becomepopular in research concerning the detection and identification of tumour markers. Thetechnique was applied to 60 large intestine tissues (26 adenocarcinomas, DUKE stages A, B,Ci, C2, 1 lymphoma, 1 adenomatous polyp, lwith Crohn disease, 1 with ekolpomatitis of thesigmoid and the respective tissues from mirror biopsy).The analysis of the polypeptides was conducted based on the isoelectric point (PI) and themolecular weight (MW). The measurement of their concentration was conducted using adensitometer and specialised software programs.The pathological and non pathological protein maps for each patient highlighted severaldifferenses in the expression of the cytoplasmic proteins attributed to the development ofmalignancy, over and above the natural complexity due to genetic polymorphism.An overexpression of many polypeptides was observed in adenocarcinoma, however in thearea of PI with pH 6.3-7.2 and MW 17.5-24 kDa, a decline in the number and intensity of theexpressed genes occurs, especially in tissues of poor differentiation.Three polypeptides with MW/PI, (51/4.2), (30/6.1) and (21/7.3), expressed inadenocarcinomas which are not detected in normal tissues and in the majority of tissues frommirror biopsy. Statistical analysis and comparison with reference data, suggest that the abovementioned polypeptides are connected with the diagnosis of the desease in premature stage,the resistance in chemotherapy substances and the development of métastasés, respectively. Inaddition, the observed concentration alterations over the progress of malignancy of 27polypeptides were considered statistically significant and important findings ofthe research.The study of the adenomatous polyp provided evidence suggesting this polyp to be aprecancerous condition. In addition, the overexpression of peptides in the area of PI with pH5.5-6.2 and MW 30-35 kDa, differentiates the pattern of the lymphoma sample to that ofadenocarcinomas, while the pattern derived from the Crohn disease is not connected tomalignant alterations. It is believed that the above findings highlighted the importantdiagnostic role of 2D-electrophoresis in cancer research.Known polypeptides and their relationship to cancer ofthe large intestine have not been studyextensively. As part of our research into cancerogenic mechanisms, the antigenic action ofknown substances was studied in 48 tissues of large intestine (23 adenocarcinomas, 1ekolpomatitis of sigmoid and the respective tissues from mirror biopsy). These were Gastricinhibitory peptide (GIP), Neurotensin, Methionin-Enkephalin, Cholecystokinin (CCK),Calcitonin and the intermediate substance 5-Hydroxytryptophan (5-HTP).The immunohistochemical method of peroxidase-antiperoxidase (PAP) was applied. Theimmunohistochemical study showed immunoreaction only for the GIP in normal mucosa. Inthe process of malignancy an increase in detected levels of the others polypeptides wasobserved in tissues of moderate differentiation of the stages DUKES B and DUKES Ci. Inparticular, high levels for hormones with nutritional action in cancer, such as the Neurotensinand the CCK were observed. Peptides GIP, Methionin-Enkephalin and CCK were not detectedin the tissues of poor differentiation, suggesting that is due to their diffusion and transfer viathe circulation to neighbouring tissues and organs or the destruction of cell membranesreceptors. On the contrary, the immunoreaction to Neurotensin is probably due to tissuereversion to an embryonic phenotype. The high percentage of 5-HTP expression in tissues of high malignancy was imply the absence ofthe enzyme L-dopa apocarvoxylase, in these tissuessince it is involved in the production ofserotonin.The detection of cancerous alteration in tissues from mirror biopsy, obtained from tissues ofadvanced colorectal cancer, with both methods described above, raizes questions as to theextent ofthe disease.Finally, it is important to note that there seems to be a good correlation between the findingsof the 2D- SDS Page protein analysis and the immunoreactivity tests applied, reinforcing theimportance ofthese findings in connection to their use as a diagnostic test ofsignificant value,leading to prompt diagnosis and the potential therapy of large intestine cancer.

Η βιοχημική μελέτη των συμπαγών όγκων παχέος εντέρου, έχει γίνει μέχρι σήμερα σεπεριορισμένο βαθμό.Στην παρούσα διατριβή αναλύθηκαν κυτταροπλασματικά πολυπεπτίδια καρκινικών καιμη καρκινικών ιστών παχέος εντέρου, με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης 2-επιπέδων,τεχνική υψηλής ευαισθησίας που πρόσφατα έγινε προσφιλής για την ανίχνευσηκαρκινικών δεικτών.Η τεχνική εφαρμόσθηκε σε 60 ιστούς παχέος εντέρου (26 αδενοκαρκινώματα σταδίωνDUKES A, B, Ci ,C2 , 1 λέμφωμα, 1 αδενωματώδης πολύποδας, 1 με νόσο του Crohn, 1με εκκολπωματίτιδα σιγμοειδούς και τους αντίστοιχους ιστούς από βιοψία καθρέπτη).Η ανάλυση των πολυπεπτιδίων έγινε με βάση το ισοηλεκτρικό σημείο (ΙΣ) και τομοριακό βάρος (MB). Η μέτρηση της συγκέντρωσής τους, έγινε μέσω πυκνομέτρου καιεξειδικευμένου λογισμικού προγράμματος.Η δημιουργία παθολογικού και μη παθολογικού «πρωτεϊνικού χάρτη» για κάθε ασθενή,ανέδειξε τη μοναδικότητά του και οδήγησε σε σημαντικά συμπεράσματα γιά τημεταβολή στην έκφραση του κυτταροπλασματικού υλικού με την ανάπτυξη τηςκακοήθειας.Παρατηρήθηκε υπερέκφραση πολλών πολυπεπτιδίων στα αδενοκαρκινώματα, όμως σεπεριοχή ΙΣ με pH 6.3-7.2 και MB 17.5-24 kDa, εμφανίζεται μείωση του αριθμού και τηςέντασης των εκφραζομένων πεπτιδίων, ιδιαίτερα στους ιστούς χαμηλής διαφοροποίησης.Τρία πολυπεπτίδια με ΜΒ/ΙΣ, (51/4.2), (30/6.1) και (21/7.3), εκφράζονται στααδενοκαρκινώματα και δεν ανιχνεύονται στη πλειοψηφία των μη καρκινικών ιστών.Από τη στατιστική επεξεργασία και τα βιβλιογραφικά δεδομένα, προκύπτει ότι αυτάσυνδέονται με την ανίχνευση της νόσου σε πρώιμο στάδιο, την αντίσταση σεχημειοθεραπευτικές ουσίες και την ανάπτυξη μεταστάσεων. Επίσης, ανιχνεύθηκαν 27πολυπεπτίδια που η μεταβολή της συγκέντρωσής τους με την πρόοδο της κακοήθειας,κρίθηκε στατιστικά πολύ σημαντική.Η μελέτη δείγματος αδενωματώδους πολύποδα, έδειξε ότι πρόκειται για προκαρκινικήκατάσταση. Επίσης, υπερέκφραση των πεπτιδίων σε περιοχή ΙΣ με pH 5.5-6.2 και MB30-35 kDa, διαφοροποιεί το ηλεκτροφόρημα του λεμφώματος από αυτό τωναδενοκαρκινωμάτων, ενώ το ηλεκτροφόρημα ιστού από νόσο του Crohn δεν συνδέεταιμε κακοήθεις εξαλλαγές. Τα ανωτέρω αναδεικνύουν το διαγνωστικό ρόλο της 2Dηλεκτροφόρησης.Η σχέση γνωστών πολυπεπτιδίων με τον καρκίνο του παχέος εντέρου δεν έχει ερευνηθείσε έκταση. Για την καλύτερη λοιπόν κατανόηση των καρκινογενετικών μηχανισμών,μελετήθηκε στην παρούσα διατριβή η αντιγονική δράση των ορμονών, Γαστρικόανασταλτικό πεπτίδιο (GIP), Νευροτενσίνη, Μεθειονίνη-Εγκεφαλίνη, Χολοκυστοκινίνη,Καλσιτονίνη και της διάμεσης ουσίας 5-Υδρόξυτρυπτοφάνη (5-ΗΤΡ), σε 48 ιστούςπαχέος εντέρου (23 αδενοκαρκινώματα, 1 εκκολπωματίτις σιγμοειδούς και οι αντίστοιχοιιστοί από βιοψία καθρέπτη).Εφαρμόσθηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος υπεροξειδάσης-αντιϋπεροξειδάσης (ΡΑΡ). Ηανοσοϊστοχημική μελέτη έδειξε ανοσοαντίδραση μόνο για το GIP στο φυσιολογικόβλεννογόνο. Με την πρόοδο της κακοήθειας παρατηρήθηκε αύξηση στην εντόπιση τωνυπολοίπων πολυπεπτιδίων σε ιστούς κυρίως μέτριας διαφοροποίησης των σταδίωνDUKES Β και DUKES Ci , ιδιαίτερα για τις ορμόνες με τροφική δράση στον καρκίνοόπως η Νευροτενσίνη και η Χολοκυστοκινίνη. Η αδυναμία εντόπισης των πεπτιδών GIP,Μεθειονίνη-Εγκεφαλίνη, Χολοκυστοκινίνη και η μειωμένη εντόπιση Καλσιτονίνης στους ιστούς χαμηλής διαφοροποίησης, οφείλεται στη καταστροφή των υποδοχέων τωνκυτταρικών μεμβρανών ή στη διάχυση και μεταφορά τους μέσω της κυκλοφορίας σεπαρακείμενους ιστούς ή όργανα. Η ανοσοαντίδραση στη Νευροτενσίνη αντίθετα,οφείλεται σε αναστροφή προς ενα εμβρυϊκό φαινότυπο ενώ ιδιαίτερα αξιολογήθηκε τουψηλό ποσοστό έκφρασης της 5-ΗΤΡ στους ιστούς υψηλής κακοήθειας. Το γεγονόςαυτό, οδηγεί σε προβληματισμό για την πιθανή έλλειψη του ενζύμου L-dopaαποκαρβοξυλάση και τον ρόλο του στην αναστολή του ενζυμικού μηχανισμούπαραγωγής της σεροτονίνης.Η εντόπιση καρκινικών αλλοιώσεων σε ιστούς από βιοψία καθρέπτη προερχομένων απόιστούς υψηλής κακοήθειας, με τις δύο μεθόδους που εφαρμόσθηκαν, αναδεικνύει τηδιαγνωστική τους αξία και προβληματίζει για το βαθμό επέκτασης της νόσου.Η συσχέτιση της έντονης ανοσοαντίδρασης πεπτιδίων με τροφική δράση στον καρκίνο(Νευροτενσίνη, Χολοκυστοκινίνη), με τις ιδιαίτερα υψηλές συγκεντρώσεις τωνπολυπεπτιδίων που ανιχνεύθηκαν και σχετίζονται με την ανάπτυξη και εξέλιξη τηςνόσου, οδηγεί στην ανάγκη ταυτοποίησής τους.Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, μπορούν να έχουν ιδιαίτερη κλινική σημασίαγια την έγκαιρη διάγνωση και τη δυνατότητα θεραπείας του καρκίνου του παχέοςεντέρου.