Προβιοτικές και τεχνολογικές ιδιότητες οξυγαλακτικών βακτηρίων. In vitro και in vivo επίδραση στο ελικοβακτήριο του πυλωρού

Abstract

Aim: The aim of this study was to examine the probiotic potential of Lactobacillus strains and to evaluate the performance of selected strains in yogurt production. In addition selected strains were applied in vivo in mice models concerning H. pylori infection and ulcerative colitis.Materials and Methods: Fifty-two Lactobacillus strains isolated from traditional Greek dairy products, obtained from international culture collections or isolated from sheep faeces, and twenty-two Streptococcus and Enterococcus strains isolated from sheep faeces were examined for properties relevant to their survival in human gastrointestinal tract. Strains were tested with respect to resistance to low pH conditions as well as resistance to bile salts and proteolytic enzymes.Their safety was evaluated by examining their haemolytic activity and their antibiotic resistance. The Lactobacillus strains were also examined on their basis of their adhesive ability to organic solvents and Caco-2 cells, and on their immune stimulatory ability using PBMCs. Also, the antimicrobial potential of the lactobacilli was examined in vitro against seven pathogenic E. coli, S. typhimurium and H. pylori strains. In addition, the lactobacilli were tested for inhibition of pathogenic E. coli and S. typhimurium adhesion to Caco-2 cells.The ability to acidify milk as well as their antagonistic activity against yogurt starters was also examined, in view of their applicability in yogurt production. As a result, selected strains were used in traditional Greek yoghurt production.In vivo, selected strains were administered in mice infected with H. pylori and their effect on stomach the gastritis grade, activity and H. pylori colonization was evaluated. Also, selected strains were administered to mice treated with TNBS in order to develop ulcerative colitis.Results: Several strains were found to possess good survival properties during their in vitro GI tract simulation trials. Many strains were able to hydrolyse bile salts and all examined strains were a- or γ- haemolytic, and displayed intrinsic antibiotic resistance in natural levels for each different species.Many strains were found to be highly adhesive to organic solvents, and while also several strains displayed good adhesion in Caco-2 cells, the strain L. plantarum ACA-DC 146 was found to be 25% adhesive, a very high percentage. The same strain, along with L. paracasei subsp. tolerans ACA-DC 4037 were found to induce high levels of pro- inflammatory cytokine secretion from PBMCs. Also, strains L. casei Shirota ACA-DC 6002, L. plantarum ACA-DC 146 and L. paracasei subsp. tolerans ACA-DC 4037 inhibited the adhesion of E. coli and S. typhimurium to Caco-2 cells in varying degrees and up to 50%.In vivo, the administration of L. casei Shirota ACA-DC 6002 in mice resulted in lower levels of gastritis grade and activity and H. pylori colonisation. Similar results, but in a somewhat lessened level were observed with strain L. paracasei subsp. tolerans ACA- DC 4037. The administration of anti-inflammatory L. casei Shirota ACA-DC 6002 in mice treated with TNBS for development of colitis resulted in lessened colitis effects in the intestine. On the other hand, the administration of pro-inflammatory L. paracasei subsp. tolerans ACA-DC 4037 did not alter the colitis development in mice. None of the tested strains could be used as starter cultures in yoghurt production because of their low acidification activity in milk. However, as they do not inhibit or are inhibited from the yoghurt starter cultures, they can easily be utilized as adjunct starters in yoghurt production. When the adjunct starter strain L. paracasei subsp. tolerans ACA-DC 4037 was used along with the traditional starter cultures, a high quality yoghurt was produced, in terms of microbiological, physicochemical and sensory properties.Conclusions: To conclude, strains L. casei Shirota ACA-DC 6002 and L. paracasei subsp. tolerans ACA-DC 4037, isolated from cheese, exhibited great probiotic potential during extensive in vitro and in vivo trials. This study confirms many of the probiotic properties attributed to L. casei Shirota and displays its potential in H. pylori infection and ulcerative colitis in mouse. In addition, the L. paracasei subsp. tolerans ACA-DC 4037 strain also exhibits potential in H. pylori infection and also awaits further development for its incorporation in a marketed probiotic yoghurt. Finally, strain L. plantarum displayed good probiotic properties and can be used is allergy alleviation models.

Σκοπός: Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η εξέταση του προβιοτικού δυναμικού στελεχών οξυγαλακτικών βακτηρίων μέσω μίας σειράς in vitro δοκιμών, και της μετέπειτα εφαρμογής επιλεγμένων στελεχών σε in vivo μοντέλα ποντικών έναντι της λοίμωξης του Η. pylori και της ελκώδους κολίτιδας, αλλά και σε τεχνολογικό επίπεδο στην παρασκευή γιαουρτιού.Υλικά και μέθοδοι: Στη διατριβή αυτή μελετήθηκαν 51 στελέχη Lactobacillus του Εργαστηρίου Γαλακτοκομίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών, απομονωμένα κυρίως από γαλακτοκομικά προϊόντα και κόπρανα προβάτων, καθώς και 22 στελέχη Enterococcus και Streptococcus, απομονωμένα από κόπρανα προβάτων. Τα στελέχη αυτά εξετάστηκαν σε μία σειρά in vitro δοκιμών που αφορούν την επιβίωσή τους σε συνθήκες εξομοίωσης του ανθρώπινου γαστρεντερικού συστήματος, οι οποίες περιελάμβαναν επιβίωση σε χαμηλό pH, επιβίωση παρουσία των πρωτεολυτικών ενζύμων πεψίνη και παγκρεατίνη, και επιβίωση παρουσία χολικών αλάτων.Στην συνέχεια τα στελέχη εξετάστηκαν σε δοκιμές βασικές για την ασφάλεια χρήσης τους στον ανθρώπινο οργανισμό. "Ολα τα στελέχη δοκιμάστηκαν ως προς την αιμολυτική τους δραστικότητα, και τα στελέχη γαλακτοβακίλλων συγκεκριμένα για την ανθεκτικότητά τους έναντι επιλεγμένων αντιβιοτικών.Παράλληλα, εξετάστηκαν in vitro βασικές ιδιότητες που θεωρούνται επιθυμητές για τα προβιοτικά στελέχη, όπως υδρόλυση των χολικών αλάτων, μελέτη της υδροφοβίας και της ικανότητας πρόσδεσης των γαλακτοβακίλλων σε κύτταρα Caco-2, ικανότητά διέγερσης κυττάρων του ανθρώπινου οργανισμού (PBMCs), καθώς και μελέτη της αντιμικροβιακής δράσης έναντι παθογόνων βακτηρίων και της δυνατότητάς αναστολής της πρόσδεσης παθογόνων σε κύτταρα Caco-2.Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκαν in vivo μελέτες σε ποντίκια, για την εξακρίβωση του προβιοτικού χαρακτήρα επιλεγμένων στελεχών. Τα στελέχη L. casei Shirota ACA-DC 6002 και L. paracasei subsp. tolerans ACA-DC 4037 χορηγήθηκαν σε ποντίκια επιμολυσμένα με Η. pylori και αξιολογήθηκε η επίδραση των γαλακτοβακίλλων αυτών στον αποικισμό του παθογόνου και στην αξιολόγηση του βαθμού και της δραστικότητας στο στομάχι. Επίσης, τα στελέχη αυτά χρησιμοποιήθηκαν και για την πρόληψη TNBS- κολίτιδας σε ποντίκια.Τέλος, επιλεγμένα στελέχη γαλακτοβακίλλων αξιολογήθηκαν για την τεχνολογική τους εφαρμογή, μελετώντας την ικανότητά οξίνϊσης του γάλακτος και τη χρήση τους ως καλλιέργειες για την παρασκευή γιαούρτηςΑποτελέσματα: Ορισμένα στελέχη βρέθηκαν να έχουν ικανοποιητική επιβίωση σε συνθήκες εξομοίωσης του ανθρώπινου πεπτικού συστήματος. Κανένα στέλεχος δεν βρέθηκε να έχει ισχυρή (β-) αιμολυτική δράση, ενώ η αντοχή των γαλακτοβακίλλων έναντι επιλεγμένων αντιβιοτικών δεν παρουσιάστηκε διαφορετική από την έμφυτη και αναμενόμενη, ανάλογα το είδος των εξεταζόμενων γαλακτοβακίλλων, ενώ αρκετά στελέχη παρουσίασαν ικανότητα υδρόλυσης χολικών αλάτων. Τα στελέχη παρουσίασαν ποικιλόμορφη πρόσδεση στους οργανικούς διαλύτες, αλλά γενικά τα περισσότερα στελέχη δεν παρουσίασαν μεγάλη υδροφοβία, ενώ αρκετά στελέχη γαλακτοβακίλλων παρουσίασαν ικανοποιητική πρόσδεση σε κύτταρα Caco-2 (>5%), με το στέλεχος L. plantarum ACA-DC 146 (25% πρόσδεση) να ξεχωρίζει. Το ίδιο στέλεχος, μαζί με το L. paracasei subsp. tolerans ACA-DC 4037 βρέθηκαν να προκαλούν την έκκριση υψηλών επιπέδων φλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-12, TNF-α και IFN-γ) από PBMCs, ενώ αντίθετα το στέλεχος L. casei Shirota ACA-DC 6002 προκάλεσε την έκκριση της αντιφλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-10. Παρόλο που κανένα από τα υπερκείμενα των στελεχών δεν παρεμπόδισε τα στελέχη E. coli, S. typhimurium και Η. pylori, ορισμένα στελέχη, όπως τα L. casei Shirota, L. plantarum ACA-DC 146 και L. paracasei subsp. tolerans ACA-DC 4037 προκάλεσαν την αναστολή της πρόσδεσης εντερικών παθογόνων (E. coli και S. typhimurium) σε κύτταρα Caco-2 σε επίπεδα μέχρι και 50%.In vivo, η χορήγηση του L. casei Shirota ACA-DC 6002 σε ποντίκια οδήγησε στην μείωση του βαθμού και της δραστικότητας της γαστρίτιδας αλλά και στον αποικισμό του Η. pylori. Παρόμοια αποτελέσματα, αλλά σε μικρότερη έκταση, παρατηρήθηκαν με την χορήγηση του στελέχους L. paracasei subsp. tolerans ACA-DC 4037. Παράλληλα, το στέλεχος L. casei Shirota ACA-DC 6002 δείχνει να παρέχει προστασία σε ποντίκια κατά την πρόκληση ελκώδους κολίτιδας με την χορήγηση TNBS.Σε τεχνολογικό επίπεδο, κανένα από τα εξεταζόμενα στελέχη δεν παρουσίασε υψηλή ικανότητα οξύνισης στο γάλα και κατά συνέπεια δεν ήταν δυνατόν να χρησιμοποιηθούν ως εναρκτήριες καλλιέργειες για την παρασκευή γιαούρτης. Από την άλλη, καθώς κανένα στέλεχος δεν παρεμποδίζει αλλά και δεν παρεμποδίζεται από τις παραδοσιακές εναρκτήριες καλλιέργειες γιαούρτης, ήταν δυνατή η χρήση τους ως συμπληρωματικές καλλιέργειας για την παρασκευή γιαούρτης. Στην συνέχεια επιλεγμένα στελέχη χρησιμοποιήθηκαν για το σκοπό αυτό και το στέλεχος L. paracasei subsp. tolerans ACA- DC 4037 ξεχώρισε όταν χρησιμοποιήθηκε ως συμπληρωματική καλλιέργεια για την παρασκευή γιαούρτης με εμβόλιο πηγμένου γάλακτος (1% ν/ν) στους 42°C, λόγω της υψηλής μικροβιακής, φυσικοχημικής και οργανοληπτικής ποιότητας του προϊόντος. Συμπεράσματα: Τα στελέχη L. casei Shirota ACA-DC 6002, L. plantarum ACA-DC 146 και L. paracasei subsp. tolerans ACA-DC 4037, επέδειξαν υποσχόμενο προβιοτικό δυναμικό κατά την διάρκεια εκτεταμένων in vitro και in vivo δοκιμών. Η μελέτη αυτή επιβεβαιώνει τις προβιοτικές ιδιότητες του L. casei Shirota και επιδεικνύει την πιθανή εφαρμογής του στη λοίμωξη του Η. pylori και στην ελκώδη κολίτιδα στον άνθρωπο. Επιπλέον, το στέλεχος L paracasei subsp. tolerans ACA-DC 4037 διαθέτει επίσης δυναμικό χρήσης έναντι του Η. pylori αλλά και στην παρασκευή ενός επιτυχημένου προβιοτικού γιαουρτιού. Τέλος, το στέλεχος L. plantarum ACA-DC 146 μπορεί να εξεταστεί in vivo σε μοντέλα αλλεργικών αντιδράσεων, λόγω της υψηλής αντιφλεγμονώδους επίδρασής τους σε ανθρώπινα περιφερειακά μονοπύρηνα (PBMCs.)