Επισήμανση του μονοκλωνικού αντισώματος anti-CEA με Sm-153: ραδιοχημική και ραδιοβιολογική αξιολόγηση

Abstract

In the present study the labeling of the monoclonal antibody anti-CEA and of the polyclonal human immunoglobulin Sandoglobuline with the radioisotope 153Sm has been investigated. Samarium-153 (t1/2 = 46.75 h) is mainly a beta emitter (Eβ = 227 keV), which can be used for therapeutic purposes, while its γ-ray (Eγ = 103 keV, 28%) facilitates scintigraphic imaging. Thus, monoclonal antibodies labeled with 153Sm can be used for combined radioimmunoscintigraphy and radioimmunotherapy. Labeling can be achieved using the bicyclic anhydride of DTPA (cDTPAa) as the bifunctional chelating agent, which, when conjugated to antibody molecules, can bind 153Sm. Labeling was performed with the addition of 153Sm, in the form of 153SmCl3 solution, to the Ab-DTPA immunoconjugate solution, at a pH range of 5.0-5.5. The reaction mixture was incubated at room temperature and free 153Sm was eliminated by gel filtration, in a Bio Gel P30 column. The labeling control was performed using a combination of radiochemical techniques (gel filtration, HPLC, ITLC-SG and SDS-PAGE). The factors, which possibly affect the labeling yield, have been investigated, in order to find out those which lead to a final product, obtainable in high yield and with high radiochemical purity. Optimization of factors (pH, Ab, Ab-DTPA concentration etc) leads to a labeling yield > 90%. The final product was obtained in radiochemical purity > 98%, which allows its use for in vivo studies. The anti-CEA-DTPA immunoconjugate was prepared using different concentrations of anti-CEA (3 to 15 mg/ml) and different molar ratios of anti-CEA:cDTPAa (1:3.5 to 1:45). The number of DTPA molecules attached per anti-CEA molecule (DTPA/anti-CEA) was determined and the effect of DTPA conjugation on the antibody molecule was studied with HPLC and SDS-PAGE. The number of DTPA/anti-CEA increases by increasing both the anti-CEA:cDTPAa molar ratio and the antibody concentration. It is obvious that this leads to an increase in labeling yield and in higher specific activity of the final product. However as a consequence, polymer formation takes place. The effect of DTPA conjugation on the in vivo distribution of the labeled antibody was evaluated in normal mice, where the differences in biodistribution were obvious, in cases of polymer species existence. The limitary number of DTPA/anti-CEA, in order to avoid polymer formation, is 1.5 and it corresponds to an anti-CEA concentration of 3 mg/ml and an anti-CEA:cDTPAa molar ratio of 1:10. In order to achieve a final product with high specific activity it is preferable to use 153SmCl3 solution with high specific activity. In the above maximum tolerated conditions the specific activity of the final product reached a maximum value of 1.2 mCi/mg, using 153SmCl3 solution with specific activity of 763 mCi/mg. The in vivo distribution of [153Sm]DTPA-anti-CEA was evaluated in nude mice, bearing experimental tumors, with anatomic and imaging techniques. The tumor was developed after local implantation of Colo 205 cancer cells, expressing carcinoembryonic antigen (CEA). The apparent association constant Ka of [153Sm]DTPA-anti-CEA for this cell line, as determined by Scatchard analysis, is 2 / 107 M-1. A comparative to nude mice biodistribution study was also performed in normal mice, in order to evaluate the effect of tumor existence in the antibody distribution. [153Sm]DTPA-anti-CEA showed slow blood clearance, it was concentrated mainly into the liver, spleen and lungs, while it was excreted through the kidneys. The comparative biodistribution study in normal and nude mice showed no significant differences in the radioactivity concentration levels in healthy tissues, for 4 hours to 2 days post injection. Differences were obvious from 3-5 days post injection, where the values in the above tissues where higher in nude mice compared to normal. An increase in radioactivity concentration in bones with time was also observed, where it was at the same level for the two kind of animals. [153Sm]DTPA-anti-CEA was evaluated in nude mice bearing tumors weighing 0.5 to 2.5 g. Focusing on tumor radioactivity concentration, higher concentration was observed in 0.5-0.8 g tumors compared to those of 1.5-2.5 g, 24 hours post injection. In nude mice bearing tumors of about the same weight tumor uptake increased with time, reaching a maximum value 2 days post injection. The biodistribution results agreed with scintigraphic studies performed on gamma camera. The tumor can be visualized 4-24 hours post injection, but due to the high background, it can be clearly distinguished from the other tissues 2 days post injection.

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επισήμανση του μονοκλωνικού αντισώματος anti-CEA και της πολυκλωνικής ανθρώπειου ανοσοσφαιρίνης Sandoglobuline, με το ραδιοϊσότοπο 153Sm. Το σαμάριο-153 (t1/2 = 46.75 h) εκπέμπει κυρίως σωματίδια β- (Eβ = 227 keV) και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για θεραπευτικούς σκοπούς, ενώ η ταυτόχρονη εκπομπή ακτινοβολίας-γ (Eγ = 103 keV, 28%) διευκολύνει στη λήψη σπινθηρογραφικής απεικόνισης. Γι’ αυτό, τα επισημασμένα με 153Sm μονοκλωνικά αντισώματα μπορούν να βρουν συνδυασμένη εφαρμογή στη ραδιοανοσοσπινθηρογράφηση και ραδιοανοσοθεραπεία. Για την επισήμανση χρησιμοποιείται ο δικυκλικός ανυδρίτης του DTPA (cDTPAa) ως το χηλικό μέσο διπλής δράσης, το οποίο συνδεδεμένο στα μόρια του αντισώματος, δύναται να δεσμεύσει το 153Sm. Η επισήμανση λαμβάνει χώρα με την προσθήκη του 153Sm, με τη μορφή διαλύματος 153SmCl3, στο διάλυμα του ανοσοσυμπλέγματος Ab-DTPA, σε pH στην περιοχή 5.0-5.5. Το μίγμα της αντίδρασης επωάζεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και το ελεύθερο 153Sm απομακρύνεται με χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε πηκτή, σε στήλη Bio Gel P30. Ο έλεγχος της επισήμανσης γίνεται με ένα συνδυασμό ραδιοχημικών τεχνικών (χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε πηκτή, HPLC, ITLC-SG και SDS-PAGE). Μελετώνται οι παράγοντες οι οποίοι πιθανόν επηρεάζουν την απόδοση της επισήμανσης, ώστε να βρεθούν εκείνοι που οδηγούν σε ένα τελικό προϊόν, με μεγάλη απόδοση και υψηλή ραδιοχημική καθαρότητα. Η κατάλληλη επιλογή των παραγόντων (pH, συγκέντρωση Ab και Ab-DTPA κ.ά) οδηγεί σε απόδοση επισήμανσης > 90%. Το τελικό προϊόν παραλαμβάνεται με ραδιοχημική καθαρότητα > 98%, ποσοστό που επιτρέπει τη χρήση του σε in vivo μελέτες. Το ανοσοσύμπλεγμα anti-CEA-DTPA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις anti-CEA (3 έως 15 mg/ml) και διαφορετικές γραμμομοριακές αναλογίες anti-CEA:cDTPAa (1:3.5 έως 1:45). Προσδιορίστηκε ο αριθμός των μορίων του DTPA που συνδέονται ανά μόριο anti-CEA (DTPA/anti-CEA) και μελετήθηκε η επίδραση της σύμπλεξης του DTPA στο μόριο του αντισώματος με HPLC και SDS-PAGE. Ο αριθμός DTPA/anti-CEA αυξάνεται με την αύξηση είτε της γραμμομοριακής αναλογίας anti-CEA:cDTPAa είτε της συγκέντρωσης του αντισώματος. Είναι προφανές ότι αυτό οδηγεί σε αύξηση του ποσοστού της επισήμανσης και σε υψηλότερη ειδική ραδιενέργεια του τελικού προϊόντος. Εντούτοις, έχει ως συνέπεια το σχηματισμό πολυμερών. Η επίδραση της σύμπλεξης του DTPA στην in vivo κατανομή του επισημασμένου αντισώματος αξιολογήθηκε σε φυσιολογικούς μυς, όπου οι διαφορές στην βιοκατανομή ήταν εμφανείς, στις περιπτώσεις της παρουσίας πολυμερών. Ο οριακός αριθμός DTPA/anti-CEA, ώστε να αποφευχθεί ο σχηματισμός πολυμερών, είναι 1.5 και αντιστοιχεί σε συγκέντρωση anti-CEA 3 mg/ml και γραμμομοριακή αναλογία anti-CEA:cDTPAa 1:10. Για την παραλαβή του επισημασμένου αντισώματος με υψηλή ειδική ραδιενέργεια είναι προτιμότερο να χρησιμοποιηθεί διάλυμα 153SmCl3 με υψηλή ειδική ραδιενέργεια. Στις παραπάνω οριακές συνθήκες η ειδική ραδιενέργεια του τελικού προϊόντος φτάνει μια μέγιστη τιμή ίση με 1.2 mCi/mg, με την χρήση διαλύματος 153SmCl3 ειδικής ραδιενέργειας 763 mCi/mg. Η in vivo κατανομή του [153Sm]DTPA-anti-CEA αξιολογήθηκε με ανατομικές και απεικονιστικές τεχνικές σε άθυμους μυς, στους οποίους είχε προκληθεί πειραματικός όγκος. Ο όγκος αναπτύχθηκε μετά από τοπική εμφύτευση των καρκινικών κυττάρων Colo 205 που εκφράζουν το καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA). Η φαινομένη σταθερά σύνδεσης Ka του [153Sm]DTPA-anti-CEA για τη συγκεκριμένη κυτταρική σειρά, όπως αυτή υπολογίστηκε βάση της ανάλυσης Scatchard, είναι ίση με 2 / 107 M-1. Παράλληλα, με τη μελέτη βιοκατανομής στους άθυμους μυς πραγματοποιήθηκε μια συγκριτική μελέτη σε φυσιολογικούς μυς, ώστε να εκτιμηθεί η επίδραση της ύπαρξης του όγκου στην κατανομή του αντισώματος μέσα στον οργανισμό. Το [153Sm]DTPA-anti-CEA παρουσιάζει βραδεία αιματική κάθαρση, συγκεντρώνεται κυρίως στο ήπαρ, τον σπλήνα και τους πνεύμονες, ενώ απεκκρίνεται μέσω των νεφρών. Η συγκριτική μελέτη βιοκατανομής σε φυσιολογικούς και άθυμους μυς δεν έδειξε σημαντικές διαφορές στη συγκέντρωση της ραδιενέργειας στους υγιείς ιστούς, για το χρονικό διάστημα από 4 ώρες έως 2 ημέρες μετά τη χορήγηση. Διαφορές ήταν εμφανείς 3-5 ημέρες μετά τη χορήγηση, όπου οι τιμές στους προαναφερόμενους ιστούς ήταν αυξημένες στους άθυμους μυς σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς. Παρατηρήθηκε επίσης μια σταδιακή αύξηση της ραδιενεργού συγκέντρωσης στα οστά με την πάροδο του χρόνου, η οποία βρισκόταν στα ίδια επίπεδα και για δύο είδη πειραματόζωων. Το [153Sm]DTPA-anti-CEA αξιολογήθηκε σε άθυμους μυς με όγκους από 0.5 έως 2.5 g. Εστιάζοντας στην συγκέντρωση της ραδιενέργειας στον όγκο, η υψηλότερη συγκέντρωση παρατηρήθηκε στους όγκους με βάρος 0.5-0.8 g, σε σύγκριση με τους αντίστοιχους βάρους 1.5-2.5 g, 24 ώρες μετά τη χορήγηση. Στους άθυμους μυς με όγκους περίπου ίδιου μεγέθους η πρόσληψη από τον όγκο αυξάνεται με το χρόνο, φτάνοντας μια μέγιστη τιμή 2 ημέρες μετά την χορήγηση. Τα αποτελέσματα συμφωνούν με τις σπινθηρογραφικές μελέτες σε γ-κάμερα. Ο όγκος μπορεί να διακριθεί 4-24 ώρες μετά τη χορήγηση, αλλά λόγω του υψηλού υπόβαθρου, μπορεί να διαχωριστεί ευκρινώς από τους υπόλοιπους ιστούς 2 ημέρες μετά τη χορήγηση.