Μελέτη των πυρηνικών πρωτεϊνών στα καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου

Abstract

Introduction: Colorectal cancer is the third most common malignancy of the western world and is considered as one of the major causes of morbidity and mortality, worldwide. At this point many studies have focused on early diagnosis and prognosis of colorectal cancer, examining the development of specific and sensitive tumor markers. Over the last fifteen years, many investigators have suggested the potential informative role of nuclear matrix (structural scaffolding of the nucleus) in distinguishing tumour malignancy, whilst they have also recognized the nuclear matrix involvement in the regulation of gene expression and the neoplastic transformation as well. In particular, the study and analysis of the nuclear matrix protein composition, which reflects tissue, cell and tumor type specificity, could better elucidate the mechanism of carcinogenesis and could provide important tools for diagnosis, prognosis and therapy of the disease. The aim of the present thesis was to observe and analyze the expression of the nuclear matrix proteins (NMPs) of human colon adenocarcinoma, and also to investigate any possible differentiation of NMP composition through the progress of malignancy. Materials and Methods: The investigation was carried out in eighty four colon adenocarcinoma samples and eighty four mirror biopsy samples. The colon adenocarcinomas were diagnosed according to Astler Coller stage and the Grade of differentiation. Ten out of the eighty were B1 adenocarcinoma (six of high and four of middle Grade), thirty were B2 adenocarcinoma (six of high, eighteen of middle and six of low 228 Grade), thirty seven were C2 adenocarcinoma (twenty seven of middle, six of middle-low and four of low Grade) and seven with D adenocarcinoma (four of middle and three of middle-low Grade). NMPs were extracted from colon and mirror biopsy tissues according to the method of Getzenberg, their concentration was determined by the Bradford protein assay, whilst they were separated according to their isoelectric point (pI) and their molecular weight (MW) by high-resolution two-dimensional electrophoresis (2D). Finally protein identification was occurred by the method of Mass Spectrometry. Results-Conclusions: By comparing the 2D electropherograms of colon adenocarcinoma tissues and mirror biopsy tissues, about 500 polypeptides were detected. We observed that most of them presented differences in their qualitative and quantitative expression. We focused on ten unique polypeptides (Πα, Πβ, Πγ, Πε, Πδ, Πζ, Leg1, HNRH1, K1C9α and K1C9β), which expressed more obviously the above differences. We believe that the unidentified polypeptides Pα and Pβ, which are mentioned for the first time in the literature, were associated with the development and progress of colon cancer, as they were present in adenocarcinoma samples and were undetected in mirror biopsies samples and as their concentration and their frequency of their presence were increasing through the different stages of malignancy. The unidentified polypeptides Πγ and Πε were detected in the late stages of disease and thus they are associated with the most aggressiveness of colon cancer. We believe that the characterization and a further study of polypeptides Πα, Πβ, Πγ and Πε could provide more profound implications in prognostic sensitivity, disease monitoring and also in precise direction of treatments. Two more unidentified polypeptides Πδ and Πζ were detected at mirror biopsies samples and they were missing or expressed in a very low level at adenocarcinomas samples. Furthermore, the above proteins demonstrated a graduate decrease (underexpression, absence) on tumor samples, through the different 229 stages of malignancy. It seems that these two polypeptides may be associated to the disease course, so any further study and analysis of these proteins and their functions could provide novel information. Our results are also quite important, regarding the analysis and study of Galectin 1 in colon cancer, as it is the first time for the above protein to be detected in nuclear proteome of colorectal cancer. The protein was undetectable /underexpressed at nuclear sample of adenocarcinomas compared with the nuclear sample of their mirror biopsies and was correlated with tumour progression of colon, as it demonstrated a graduate decrease (underexpression, absence) in the nuclear sample of adenocarcinomas, through the different stages of malignancy. According to our results and to previous researchers who observed overexpression of Leg1 in cytoplasm of colon cancer cells in the stroma around the tumor and also in epithelial cells, it seems that neoplastic progression is associated with a shift of Leg1 from the nucleus towards the cytoplasm. According to the above and also to the already known involvement of Leg1 in gene regulation, tumor development and metastasis, this protein seems to be connected with genesis of colon cancer and we suggest that a more sensitive and extensive analysis of this protein, could enhance a better knowlegment and management of the colorectal cancer. ...

Εισαγωγή: Ο καρκίνος του παχέος εντέρου, είναι ο τρίτος συχνότερα αναφερόμενος καρκίνος στις ανεπτυγμένες χώρες και μία από τις βασικότερες αιτίες νοσηρότητας και θνησιμότητας, παγκοσμίως. Στην προσπάθεια αντιμετώπισης της νόσου, ένας μεγάλος αριθμός ερευνών έχει επικεντρωθεί στην έγκαιρη διάγνωση και πρόγνωση του καρκίνου, εξετάζοντας την ανάπτυξη ειδικών και ευαίσθητων καρκινικών δεικτών. Τα τελευταία δεκαπέντε χρόνια, πολλοί ερευνητές υποστηρίζουν τη σημαντικότητα της πυρηνικής μήτρας (στηρικτική δομή του πυρήνα), δεδομένου του ότι συμμετέχει στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και εμπλέκεται άμεσα με την εξαλλαγή των φυσιολογικών κυττάρων, σε νεοπλασματικά. Ειδικά η μελέτη και αναγνώριση της πρωτεϊνικής της σύνθεσης, η οποία παρουσιάζει εξειδίκευση κυτταρική, ιστολογική, αλλά και εξειδίκευση ως προς συγκεκριμένους καρκίνους, παρέχει σημαντικές πληροφορίες για τους μηχανισμούς καρκινογένεσης, καθώς και για τη διάγνωση, την πρόγνωση και την σωστή κατεύθυνση της θεραπείας της νόσου. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη και ανάλυση της έκφρασης των πρωτεϊνών της πυρηνικής μήτρας κυττάρων, προερχόμενων από καρκινικά δείγματα παχέος εντέρου και δείγματα βιοψίας καθρέπτη, καθώς και η μελέτη της μεταβολής της έκφρασης αυτών των πρωτεϊνών, με την πρόοδο της κακοήθειας. Υλικά και Μέθοδοι: Συγκεντρώθηκαν ογδόντα τέσσερις καρκινικοί ιστοί παχέος εντέρου και ογδόντα τέσσερις ιστοί από βιοψία καθρέπτη. Από τους ογδόντα τέσσερις καρκινικούς ιστούς, οι δέκα ήταν αδενοκαρκινώματα σταδίου Β1 (έξι υψηλής και τέσσερις μέσης διαφοροποίησης), οι τριάντα ήταν αδενοκαρκινώματα σταδίου Β2 (έξι υψηλής, δεκαοκτώ μέσης και έξι χαμηλής διαφοροποίησης), οι τριάντα επτά ήταν αδενοκαρκινώματα σταδίου C2 (είκοσι επτά μέσης, έξι μέσης-χαμηλής και τέσσερις χαμηλής διαφοροποίησης) και τέλος οι επτά διαγνώσθηκαν ως αδενοκαρκινώματα σταδίου D (τέσσερις μέσης και τρεις μέσης- χαμηλής διαφοροποίησης). Η απομόνωση των πυρηνικών πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο του Getzenberg, η συγκέντρωση τους στα δείγματα καθορίστηκε με τη μέθοδο Bradford και η ανάλυση τους έγινε με την ηλεκτροφόρηση πολυακριλαμίδης 2 επιπέδων. Τέλος η διαδικασία της ταυτοποίησης των πρωτεϊνών αυτών πραγματοποιήθηκε με την τεχνική της φασματοσκοπίας μάζας. 224 Αποτελέσματα-Συμπεράσματα: Στα ηλεκτροφορήματα των καρκινικών δειγμάτων και των δειγμάτων βιοψίας καθρέπτη που μελετήσαμε στην παρούσα διατριβή, ανιχνεύθηκαν περίπου 500 πολυπεπτίδια, εκ των οποίων ένας μεγάλος αριθμός παρουσίασε διαφορές ποιοτικής και ποσοτικής έκφρασης. Επικεντρωθήκαμε σε δέκα πολυπεπτίδια (τα Πα, Πβ, Πγ, Πε, Πδ, Πζ, τη Γαλεκτίνη-1, την Ετερογενή Πυρηνική Ριβονουκλεοπρωτεΐνη Η1, και σε δύο ισόφορμα της Κυτταροκερατίνης-9), τα οποία παρουσίασαν σημαντική και επαναλαμβανόμενη μεταβολή στην έκφραση τους, στη συντριπτική πλειοψηφία των δειγμάτων. Πιστεύουμε ότι τα πολυπεπτίδια Πα και Πβ , τα οποία είναι καινούρια δεδομένου ότι για πρώτη φορά αναφέρονται στην διεθνή βιβλιογραφία, συνδέονται με την εμφάνιση του καρκίνου του παχέος εντέρου, καθόσον ανιχνεύτηκαν στα καρκινικά δείγματα, ενώ απουσίαζαν από τα δείγματα βιοψίας καθρέπτη και επιπλέον συνδέονται άμεσα με την εξέλιξη του καρκίνου, δεδομένου ότι εμφάνισαν αύξηση στη συχνότητα παρουσίας τους και στην συγκέντρωση τους, ανάλογη της επιθετικότητας την νόσου. Άλλα δύο καινούρια πολυπεπτίδια, τα Πγ και Πε εντοπίστηκαν σε καρκινικά δείγματα προχωρημένων σταδίων της νόσου, γεγονός που θεωρούμε ότι τα συνδέει με τις επιθετικότερες μορφές της. Ο χαρακτηρισμός και η περαιτέρω ανάλυση των πολυπεπτιδίων Πα, Πβ, Πγ και Πε, καθώς και η μελέτη του ρόλου τους στην καρκινογένεση, μπορεί να προσφέρει σημαντικές πληροφορίες για την ακριβέστερη ταξινόμηση των αδενοκαρκινωμάτων του παχέος εντέρου, να συμβάλλει στην πρόγνωση του καρκίνου στο παχύ έντερο και να οδηγήσει στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση του. Τα πολυπεπτίδια Πδ και Πζ, τα οποία δεν ταυτοποιήθηκαν με καμία μέχρι σήμερα από τις γνωστές πρωτεΐνες, στα καρκινικά δείγματα, είτε παρουσίασαν ασθενή έκφραση σε σχέση με τα δείγματα βιοψίας καθρέπτη, είτε απουσίαζαν. Επιπλέον η ποσότητα τους παρουσίασε μείωση, ανάλογη με την επιθετικότητα της νόσου. Από τις ανωτέρω παρατηρήσεις φαίνεται ότι τα καινούρια αυτά πολυπεπτίδια πιθανόν να σχετίζονται με την πορεία της νόσου και επομένως η περαιτέρω επεξεργασία τους, καθώς και η μελέτη της λειτουργίας τους, θεωρείται σημαντική. Σημαντική πιστεύουμε ότι είναι η μελέτη μας, ως προς την Γαλεκτίνη 1 (Leg1), καθώς για πρώτη φορά αναφέρεται ο εντοπισμός της σε πυρηνικό κλάσμα καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Στους πυρήνες των καρκινικών δειγμάτων είτε παρουσίαζε ασθενέστερη συγκέντρωση σε σχέση με τα δείγματα βιοψίας καθρέπτη, είτε απουσίαζε. ...