Μεταβολισμός ενδοκανναβινοειδών σε πρωτόζωα: Χαρακτηρισμός της αμιδοϋδρολάσης των λιπαρών οξέων

Abstract

Fatty acid amidohydrolase (FFAH) is a membrane bound enzyme found in a variety of mammalian cells, plants and some invertebrates. The enzyme is responsible for the catabolism and therefore the inactivation of endocannabinoids, including the neuromodulatory amide, anandamide (N-arachidonylethanolamine). In the present study, the metabolism of [3H]anandamide by Tetrahymena pyriformis possibly through FAAH was investigated. The results showed that [3H]anandamide was taken up and rapidly metabolized by Tetrahymena pyriformis cells. The main metabolic products were PL and water soluble metabolites. The production of PL was inhibited by the addition of phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and the strong FAAH inhibitor arachidonytrifloromethylketone (ATFMK) suggesting the presence of FAAH activity. Arachidonic acid was apparently incorporated into PLs and non-polar lipids after its conversion to other fatty acids. Anandamide uptake by intact cells seemed to take place through passive diffusion and not by a tranporter mediated mechanism since it is not dependent on temperature and substrate concentration. We also found for the first time that Tetrahymena pyriformis starvation medium contained FAAH activity that rapidly metabolizes anandamide, mainly to arachidonic acid, in a time- and concentration-dependent manner. Kinetic experiments demonstrated that the released enzyme had an apparent Km of 3.7μΜ and Vmax 278pmol/minxmg. Amidohydrolase activity is maximal at pH 8-10 and was abolished by PMSF and by ATFMK. Furthermore, unsaturated and monounsaturated analogues of anandamide inhibited anandamide metabolism suggesting that the enzyme was not specific for anandamide. FAAH was rapidly released in the starvation medium (~60% in 2min) and the secretion was completed after ~2hours. The release of the enzyme was enhanced by inophore A23187, dibucaine and by osmotic shock. The FAAH activity in Tetrahymena pyriformis cells homogenate was subsequently characterized. The metabolism of anandamide was time dependent and completed after ~20min. The optimum pH was 9-10 and the optimum temperature 20-300C. The enzyme followed Michaelis-Menten kinetics showing Km 2mM and Vmax 20.64nmol/minxmg and was inhibited by PMSF and ATFMK. Subcellular fractionation of Tetrahymena pyriformis homogenate showed that the activity was present in all subcellular fractions with highest specific activity in the microsomal as well as in non microsomal membrane fractions.

Αντικείμενο της διατριβής αποτέλεσε η μελέτη του μεταβολισμού του ενδοκανναβινοειδούς Ν-αραχιδονυλοαιθανολαμίνη (ανανταμίδιο) με έμφαση στο ένζυμο αποικοδόμησής του αμιδοϋδρολάση των λιπαρών οξέων (FAAH) σε ένα μονοκύτταρο ευκαρυωτικό οργανισμό την Tetrahymena pyriformis. Η FAAH είναι ένα μεμβρανικό ένζυμο που έχει μελετηθεί σε κύτταρα θηλαστικών. Έχει βρεθεί σε φυτά και σε μερικά ασπόνδυλα. Υδρολύει και με τον τρόπο αυτό απενεργοποιεί δραστικά λιπίδια (παράγωγα λιπαρών οξέων) τα οποία εμπλέκονται σε σημαντικές φυσιοπαθολογικές λειτουργίες όπως συμπεριφορά, πόνος, ύπνος, όρεξη. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώθηκε ότι η Tetrahymena προσλαμβάνει και μεταβολίζει ταχύτατα το [3Η]ανανταμίδιο σε ποσοστό ~55% στα 5 λεπτά, με κατανομή ραδιενέργειας κυρίως σε φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη και άλλα πολικά φωσφολιπίδια. Σε μικρότερο ποσοστό σχηματίζονται υδατοδιαλυτά προϊόντα. Τόσο το φαινυλμεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF) όσο και η αραχιδονυλοτριφθορομεθυλοκετόνη (ATFMK) αναστέλλουν τον μεταβολισμό υποδεικνύοντας ενζυμική δραστικότητα FAAH. Η απουσία αραχιδονικού οξέος από τα προϊόντα οδηγεί στο συμπέρασμα ότι σε άθικτα κύτταρα δρουν και άλλα ένζυμα στον μεταβολισμό του ανανταμιδίου που πιθανότατα μεταβολίζουν το σχηματιζόμενο αραχιδονικό οξύ σε άλλους μεταβολίτες ή το ενσωματώνουν στα φωσφολιπίδιά τους. Μελέτη της πρόσληψης του ανανταμιδίου έδειξε ότι σε αντίθεση με άλλους τύπους κυττάρων, η μεταφορά του ανανταμιδίου σε κύτταρα Tetrahymena pyriformis δε γίνεται μέσω ειδικού μεταφορέα αλλά πιθανότατα με παθητική διάχυση με βάση τη διαφορά συγκέντρωσης μέσα και έξω από το κύτταρο. Η μεταφορά αυτή διευκολύνεται από το γεγονός ότι το ανανταμίδιο που προσλαμβάνεται μεταβολίζεται ταχύτατα στη συνέχεια από την FAAH. Διαπιστώθηκε επίσης για πρώτη φορά ότι τα κύτταρα Tetrahymena pyriformis εκκρίνουν ένζυμο το οποίο μεταβολίζει ταχύτατα το ανανταμίδιο στον εξωκυττάριο χώρο κυρίως σε αραχιδονικό οξύ. Το ένζυμο αυτό είναι πιθανότατα η αμιδοϋδρολάση των ελεύθερων λιπαρών οξέω (FAAH) η οποία είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι μεταβολίζει το ανανταμίδιο σε αραχιδονικό οξύ και αιθανολαμίνη. Η παραπάνω διαπίστωση επιβεβαιώνεται και από το γεγονός ότι τόσο η ATFMK όσο και ο PMSF, δύο ισχυροί αναστολείς της FAAH αναστέλλουν σχεδόν πλήρως την υδρόλυση του ανανταμιδίου. Ο μεταβολισμός του ανανταμιδίου αυξάνει σε συνάρτηση με το χρόνο, εξαρτάται από τη συγκέντρωση πρωτεΐνης και τη συγκέντρωση υποστρώματος με φαινόμενο Km 3,7mM και Vmax 278pmol/minxmg. Το ένζυμο έχει αλκαλικό βέλτιστο pH(8-10) και δεν είναι ειδικό ως προς το ανανταμίδιο αλλά μεταβολίζει και άλλες Ν-ακυλοαιθανολαμίνες. Η έκκριση της FAAH σε μέσο ασιτίας γίνεται πολύ γρήγορα (~60% στα 2 λεπτά) και ολοκληρώνεται στις ~2 ώρες. Προσθήκη του ιονοφόρου Α23187 και διβουκαΐνης στο μέσο ασιτίας οδήγησαν σε διέγερση της έκκρισης ενώ διέγερση προκάλεσε και η προσθήκη NaCl σε συγκέντρωση 0,15Μ πιθανότατα προκαλώντας ωσμωτικό σοκ στα κύτταρα. Μελέτη του μεταβολισμού του ανανταμιδίου σε ομογενοποίημα κυττάρων έδειξε ότι το ένζυμο του ομογενοποιήματος εμφανίζει ομοιότητες με το εκκρινόμενο ένζυμο. Η υδρόλυση του ανανταμιδίου σε ομογενοποίημα κυττάρων εξαρτάται από το χρόνο επώασης με το επισημασμένο υπόστρωμα. Είναι ταχύτατος, ολοκληρώνεται στα 20 λεπτά, εξαρτάται από τη συγκέντρωση πρωτεΐνης και τη συγκέντρωση υποστρώματος. Κινητική μελέτη έδειξε ότι η ενζυμική δραστικότητα του ομογενοποιήματος ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten με φαινόμενο km 2μΜ και Vmax 20,60 nmol/minxmg. Το ένζυμο εμφανίζει βέλτιστο pH στην περιοχή 9-10 και βέλτιστη θερμοκρασία τους 20-300C. Τέλος, αναστέλλεται από αναστολείς της FAAH και δεν εμφανίζει εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα. Υποκυτταρική κατανομή της ενζυμικής δραστικότητας έδειξε ότι πρόκειται για μεμβρανικό ένζυμο το οποίο εντοπίζεται κυρίως στην πλασματική μεμβράνη και στις μεμβράνες των μικροσωμάτων. Τέλος, προσπάθεια καθαρισμού και ταυτοποίησης είχει ως αποτέλεσμα την εξαγωγή πρώτων συμπερασμάτων ως προς την υποκυτταρική κατανομή και το ΜΒ που δίνουν το έναυσμα για παραπέρα μελέτη και τελική ταυτοποίησή του.