Μηχανισμός δράσης και μεταβολισμός των Ν-ακυλοαιθανολαμινών. Μελέτη της επίδρασης της Ν-αραχιδονυλοαιθανολαμίνης στα αιμοπετάλια

Abstract

In the present study, we studied the effect of various N-acylethanolamines and especially anandamide (N-arachidonoylethanolamine) on rabbit and human platelets. In rabbit platelets, anandamide induces a dose-dependent aggregation at 7-35 μM, whose initiation has a delay time of 40-60 sec. The aggregation took place through an arachidonic-dependent pathway. N-oleoyl and N-palmitoylethanolamine don’t induce platelet aggregation in concentrations as high as 100 μM. N-oleoylethanolamine at 300 μM inhibits platelet aggregation induced by anandamide 10 μM while at 100 μM, the aggregation induced by PAF 2.5x10-10M. Intact rabbit platelets rapidly metabolize [3H] anandamide (t1/2= 5min). Metabolism is completed after 20 min and the main products are water-soluble and in a smaller extent polar lipids whereas the radioactivity found in the free arachidonic acid fraction is very low. PMSF, a strong FAAH inhibitor completely abolishes metabolism, indicating the existence of FAAH activity in rabbit platelets. According to the nature of the products though, the existence of other enzymatic systems as well is indicated. Rabbit platelets accumulate [3H] anandamide rapidly and then they metabolize it to water-soluble compounds that are secreted in the medium. [3H] anandamide uptake by rabbit platelets seem to take place through passive diffusion and not by a transporter . Binding experiments showed that rabbit platelets lack specific sites of [3H] anandamide binding. Rabbit platelet homogenate as well as the membrane fraction (P-2), the microsome fraction and the cytosol contain FAAH activity. The enzyme of the homogenate and the P-2 fraction follow Michaelis-Menten kinetics showing Κm 14.4±2.3 μΜ and 8.2±0.8 respectively and vmax 1.3±0.1 nmoL/min x mg protein και 1.7±0.06 respectively. The optimum pH is 9-10 and the optimum temperature 37-50οC. Anandamide induces also human platelet aggregation at concentrations higher than 50 μΜ but in an arachidonate-independent pathway. Incubation with various inhibitors didn’t cause inhibition of the aggregation with the exception of wortmannin and quercetin. Intact human platelets are capable of metabolizing [3H] anandamide in a way that is partly inhibited by PMSF. The main product is free arachidonic acid while the level of water-soluble compounds is low. Human platelet homogenate as well as the membrane fraction (P-2) and the microsome fraction contain FAAH activity. The enzyme of the homogenate follows Michaelis-Menten kinetics showing Κm 34.7±5.1 μΜ and vmax 442.9 ±38.0 pmoL/min x mg protein.

Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκαν διάφορες Ν-ακυλοαιθανολαμίνες και κυρίως το ανανταμίδιο (Ν-αραχιδονυλοαιθανολαμίνη ως προς την επίδρασή τους σε αιμοπετάλια κουνελιού καθώς και ανθρώπου. Στα αιμοπετάλια κουνελιού, το ανανταμίδιο προκαλεί με δοσοεξαρτώμενο τρόπο συσσώρευσή τους σε συγκεντρώσεις από 7-35 μΜ , η έναρξη της οποίας καθυστερεί από 40-60 sec. Η συσσώρευση λαμβάνει χώρα μέσω μεταβολισμού του ανανταμιδίου προς αραχιδονικό οξύ. Η Ν-ελαϋλο- και η Ν-παλμιτυλοαιθανολαμίνη στερούνται συσσωρευτικής ικανότητας ακόμη και σε συγκεντρώσεις μέχρι 300 μΜ. Η Ν-ελαϋλοαιθανολαμίνη όμως σε συγκεντρώσεις της τάξης των 300 μΜ αναστέλλει πλήρως τη συσσωρευτική ικανότητα του ανανταμιδίου 10 μΜ, ενώ σε μικρότερες συγκεντρώσεις 50-100 μΜ αναστέλλει πλήρως τον PAF (2.5x10-10 M), ισχυρότατο αγωνιστή των αιμοπεταλίων. Η αναστολή που προκαλεί η Ν-ελαϋλοαιθανολαμίνη στο ανανταμίδιο είναι δυνατό να οφείλεται είτε σε αναστολή του μεταβολισμού του από την αμιδοϋδρολάση των λιπαρών οξέων (FAAH) είτε σε σύνδεση του μονοακόρεστου αναλόγου σε κάποιο τύπο υποδοχέα (υποδοχέα των κανναβινοειδών ή κάποιου άλλου τύπου υποδοχέα) μέσω του οποίου ασκεί πιθανόν τη δράση του το ανανταμίδιο στα αιμοπετάλια κουνελιού. Για το λόγο αυτό, μελετήθηκε ο μεταβολισμός επισημασμένου με [3Η]- ανανταμιδίου από άθικτα αιμοπετάλια (in vivo μεταβολισμός) και από ομογενοποίημα αυτών (in vitro μεταβολισμός) καθώς και η ύπαρξη ειδικής σύνδεσης του [3Η]ανανταμιδίου στα κύτταρα αυτά. Τα άθικτα αιμοπετάλια κουνελιού μεταβολίζουν ταχύτατα το [3Η]ανανταμίδιο (t1/2= 5 min), ο μεταβολισμός ολοκληρώνεται στα 20 min με κατανομή της ραδιενέργειας σε υδατοδιαλυτά μόρια κυρίως, και πολύ λιγότερο σε πολικά λιπίδια-φωσφολιπίδια, ενώ το ποσοστό στο ελεύθερο αραχιδονικό οξύ είναι εξαιρετικά χαμηλό. Δεδομένου, ότι ο μεταβολισμός αυτός αναιρείται πλήρως από την παρουσία του φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθοριδίου (PMSF), ισχυρού αναστολέα της FAAH, συμπεραίνεται ότι υπάρχει η συγκεκριμένη ενζυμική δραστικότητα στα αιμοπετάλια κουνελιού. Από τη φύση των προϊόντων όμως, φαίνεται ότι υπάρχουν και άλλο(α) ενζυμικό (ά) συστήματα που δρουν είτε απευθείας στο ανανταμίδιο είτε στο παραγόμενο, μέσω υδρόλυσης από τη FAAH, αραχιδονικό οξύ. Χρησιμοποίηση διαφόρων αναστολέων έδειξε ότι η παρουσία κάποιου καταλοίπου κυστεΐνης είναι πολύ σημαντική για την εμφάνιση μεταβολικής ικανότητας του ανανταμιδίου από τα αιμοπετάλια. Στην προσπάθεια διευκρίνισης της ύπαρξης ειδικού μεμβρανικού μεταφορέα του ανανταμιδίου προς το εσωτερικό των αιμοπεταλίων, βρέθηκε ότι ταχύτατα τα κύτταρα προσλαμβάνουν το [3Η]ανανταμίδιο το οποίο όμως μεταβολίζεται προς υδατοδιαλυτά προϊόντα τα οποία εκκρίνονται στον εξωκυττάριο χώρο, με αποτέλεσμα την αύξηση της ραδιενέργειας με την πάροδο του χρόνου στον εξωτερικό χώρο. Σε αντίθεση με άλλους τύπους κυττάρων που έχουν μελετηθεί, στα αιμοπετάλια κουνελιού η πρόσληψη ανανταμιδίου δε γίνεται μέσω ειδικού μεμβρανικού μεταφορέα (διευκολυνόμενη διάχυση) αλλά με μη ειδικό τρόπο (παθητική διάχυση) δεδομένου ότι η διαδικασία της πρόσληψης δεν εξαρτάται από τη θερμοκρασία και το μέγεθος αυτής έχει γραμμική σχέση με το υπόστρωμα και δε φθάνει σε κορεσμό. Η διερεύνηση της ύπαρξης ειδικής σύνδεσης του ανανταμιδίου στα αιμοπετάλια κουνελιού έδειξε ότι τα συγκεκριμένα κύτταρα δε διαθέτουν περιοχές με ειδική σύνδεση για το ανανταμίδιο δεδομένου ότι η ολική και η μη ειδική σύνδεση συμπίπτουν. Το ομογενοποίημα αιμοπεταλίων κουνελιού καθώς και τα κλάσματα των μεμβρανών (P-2), των μικροσωμάτων (P-3) και το κυτοσόλιο εμφανίζουν ενζυμική δραστικότητα FAAH. Η γραμμική περιοχή είναι 0-40 μg πρωτεΐνης τόσο στο ομογενοποίημα όσο και στα κλάσματα P-2 και P-3 ενώ τα προϊόντα μεταβολισμού είναι κυρίως πολικά λιπίδια-φωσφολιπίδια και υδατοδιαλυτά προϊόντα αλλά και σε σχετικά μεγάλο ποσοστό ελεύθερο αραχιδονικό οξύ. Κινητικές μελέτες έδειξαν ότι η ενζυμική δραστικότητα από ομογενοποίημα και κλάσμα P-2 ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten με Κm ίσο με 14.4±2.3 μΜ και 8.2±0.8 μΜ αντίστοιχα και vmax 1.3±0.1 nmoL/minxmg πρωτεΐνης και 1.7±0.06 nmoL/minxmg πρωτεΐνης αντίστοιχα. Η ενζυμική δραστικότητα εμφανίζει βέλτιστο pH 9-10 και βέλτιστη περιοχή θερμοκρασιών 37-50οC. Τέλος, η ενζυμική δραστικότητα δεν εμφανίζει ιδιαίτερη εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα και αναστέλλεται με παρόμοιο τρόπο με τη FAAH ήπατος και εγκεφάλου ποντικού. Τα ανθρώπινα αιμοπετάλια συσσωρεύονται επίσης από ανανταμίδιο σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 50 μΜ, η έναρξη της συσσώρευσης καθυστερεί 25-40 sec αλλά δε γίνεται μέσω μεταβολισμού του ανανταμιδίου προς αραχιδονικό οξύ. Επίδραση με διάφορους αναστολείς των δρόμων ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων δεν ανέστειλε τη διαδικασία της συσσώρευσης με εξαίρεση το φλαβονοειδές κερκετίνη και τη βορτμαννίνη. Η επίδραση των δύο άλλων Ν-ακυλοαιθανολαμινών στα ανθρώπινα αιμοπετάλια είναι αντίστοιχη με αυτή στου κουνελιού. Τα άθικτα ανθρώπινα αιμοπετάλια έχουν την ικανότητα μεταβολισμού επισημασμένου ανανταμιδίου που αναστέλλεται μερικώς από την παρουσία PMSF. Το μεγαλύτερο ποσοστό των προϊόντων είναι ελεύθερο αραχιδονικό οξύ ενώ είναι πολύ μικρό το ποσοστό των υδατοδιαλυτών συστατικών. Το ομογενοποίημα και τα κλάσματα των μεμβρανών και των μικροσωμάτων μεταβολίζουν το [3Η]ανανταμίδιο με γραμμική περιοχή πρωτεΐνης από 0-70 μg. Η ενζυμική δραστικότητα του ομογενοποιήματος ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten με Κm ίσο με 34.7±5.1 μΜ και vmax 442.9±38.0 pmoL/min x mg πρωτεΐνης.