Η συμβολή των καλλιεργειών αιμοποιητικών κυττάρων στη μελέτη της αναιμίας της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας

Abstract

Anemia is a frequent manifestation of chronic renal failure (CRF) and is probably caused by multiple factors. Recent data suggest for a possible inhibitory effect of inflammatory cytokines on CRF erythropoiesis. In order to investigate the role of cytokines in the pathogenesis of CRF anemia we studied the effect of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) supernatants from CRF patients on haematopoietic colony formation in vitro.The effect of PBMC supernatants from 111 CRF patients and 33 healthy volunteers (normal contols) on normal erythroid progenitors (BFU-E) colony formation was studied. The patients (pts) had either end-stage CRF without replacement (CRF-WR) (41 pts) or end-stage CRF on replacement, more than 6 months on the same method, [42 pts on hemofiltration (CRF-HF) and 28 on continuous ambulatory peritoneal dialysis (CRF-CAPD)]. Twenty ml of peripheral blood was drawn after informed consent. Mononuclear cells were separated by sedimentation on Ficoll-Hypaque, washed thrice with Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM), resuspended in IMDM with 10% fetal calf serum and cultured in a concentration 2x106 /mL at 37o C, 5% CO2 for 48 hours with the addition of phytohemagglutinin. The PBMC supernatants were collected after centrifugation (300 g x 10 min) and stored (-70o C). Peripheral blood was drawn from normal controls after informed consent. After mononuclear cells were separated as was previously described, a suspension of 2x 105/mL cells were plated in duplicate in 35-mm Petri dishes in a medium composed of MethoCult H4330 and 10% PBMC supernatants (from CRF patient or from normal control). The dishes were incubated at 37o C in a 5% CO2 humidified chamber. The formation of normal BFU-E colonies (orange to red burst of at least 3 subclusters or a single cluster containing ?100 cells) was scored on day 14 using an inverted microscope. The TNF-α, IFN-γ and IL-3 levels of PBMC supernatants were measured by ELISA assay. The polyclonal neutralizing antibodies against TNF-α, IFN-γ were manufactured by R & D Systems Inc. Either 4-5 μg/mL anti-TNF-α or 12-16 μg/mL anti- IFN-γ or both of them or normal goat IgG were incubated with 300 μL PBMC supernatant for 30 min and added to the culture’s medium. Τhe PBMC supernatants from CRF patients were found to suppress the BFU-E colony formation (BFU-E with pbmc supernatants from controls: 68±55/2x105/mL cells vs BFU-E with PBMC supernatants from CRF patients: 44±35/2x105/mL cells, p= 0,0006). Τhe suppression of the colony formation (66% of the control) was similar in the three subgroups of crf patients. Τhe TNF-α levels in pbmc supernatants from crf patients were elevated compared with the controls (2,23±1,29 ng/ml vs 1,55±1,20 ng/ml, p=0,006) whereas IFN-γ were not. Τhe addition of a polyclonal antibody to TNF-α reversed almost completely this suppression (BFU-E with pbmc supernatants from crf patients: 66% of the control colony formation vs bfu-e with pbmc supernatants from CRF patients + anti-tnf-α: 93% of the control colony formation, p<0,001). Τhe addition of anti- ifn-γ did not alter the bfu-e formation (p=0,948). Ιn conclusion: 1. Peripheral blood mononuclear cells from end-stage crf patients produce spontaneously increased levels of tnf-α, which is res-ponsible for the in vitro suppression of erythropoiesis induced by pbmc supernatants. 2. The suppression of erythropoiesis is independent of renal function replacement or the type of replacement. 3. Our study confirms the results from Αllen et al 1999 who used sera of crf patients. 4. Our study provides evidence for a pathogenic role for tnf-α in the anemia of crf patients similar with anemia of chronic disease. pbmc supernatants from crf patients suppress erythropoiesis in vitro and this effect is reversed by the addition of polyclonal antibodies to tnf-α. 5. The suppression of erythropoiesis could possibly be enhanced with a concurrent infection or inflammation. 6. Our results partly explain the resistance to treatment with rh-Εpo in crf patients

Η αναιμία αποτελεί συχνή εκδήλωση της χρόνιας νεφρικής ανεπάρ-κειας (ΧΝΑ) και στην παθογένειά της συμμετέχουν πολλοί παράγοντες. Πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα συνηγορούν ότι στην ανάπτυξη της αναιμίας της ΧΝΑ ενδεχομένως συμβάλλει και η παρουσία στον ορό των ασθενών ευοδωτικών της φλεγμονής κυτταροκινών. Σκοπός της μελέτης μας ήταν να ερευνήσουμε με τη μέθοδο της in vitro καλλιέργειας προγο-νικών αιμοποιητικών προβαθμίδων τον πιθανό ρόλο των κυτταροκινών στο μηχανισμό ανάπτυξης της αναιμίας της ΧΝΑ. Η πειραματική μελέτη αφορούσε την επίδραση των υπερκείμενων από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (ΜΚΠΑ) 111 ασθενών με ΧΝΑ (41 ασθενείς με ΧΝΑ χωρίς υποκατάσταση, 42 ασθενείς με ΧΝΑ σε αιμοκάθαρση και 28 ασθενείς με ΧΝΑ σε συνεχή φορητή περιτοναϊκή κάθαρση) και 33 υγιών εθελοντών (ομάδα ελέγχου) στην ανάπτυξη αποι-κιών από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα της ερυθράς σειράς (BFU-E) του αίματος φυσιολογικών ατόμων. Οι αιμοληψίες περιφερικού αίματος γίνονταν μετά από πλήρη ενη-μέρωση και συγκατάθεση του ασθενούς. Τα μονοπύρηνα κύτταρα διαχω-ρίζονταν με φυγοκέντρηση στο διαχωριστικό μέσο Ficoll-Hypaque, εκπλύνονταν τρεις φορές με Iscove's Modified Dulbeccos Medium (IMDM), εμπλουτισμένο κατά 2% με ορό εμβρύου μόσχου (fetal calf serum, FCS) και τοποθετούνταν σε φλάσκες με IMDM και 10% FCS σε συγκέντρωση 2x106/mL με ή χωρίς την προσθήκη φυτοαιμοσυγκολλη-τίνης (PHA). Ακολουθούσε η επώασή τους στους 37o C σε περιβάλλον με 5% CO2 για 48 ώρες. Η συλλογή των υπερκείμενων ΜΚΠΑ γίνονταν μετά από φυγοκέντρηση (300g/min) και αποθηκεύονταν στους - 70o C. Οι αιμοληψίες για τις καλλιέργειες προγονικών αιμοποιητικών προβαθμίδων γίνονταν από υγιείς εθελοντές. Τα ΜΚΠΑ διαχωρίζονταν όπως ήδη περιγράψαμε και ένα εναιώρημα 2x105/mL κυττάρων τοποθε-τούνταν εις διπλούν σε τρυβλία Petri-35 mm σε καλλιεργητικό υλικό MethoCult H4330 μαζί με ποσότητα 10% υπερκείμενου (από ασθενείς με ΧΝΑ ή υγιείς δότες). Τα τρυβλία επωάζονταν σε κλίβανο με 95% υγρασία, 37o C και 5% CO2. Η ανάπτυξη φυσιολογικών BFU-E αποικιών καταμετρούνταν τη 14η ημέρα σε ανάστροφο μικροσκόπιο. Τα επίπεδα των TNF-α, IFN-γ και της IL-3 στα υπερκείμενα ΜΚΠΑ μετρήθηκαν με τη μέθοδο ELISA. Παράλληλα με τις απλές καλλιέργειες που περιγράψα-με παραπάνω γίνονταν και καλλιέργειες με τη χρήση υπερκείμενων ΜΚΠΑ τα οποία παρασκευάζονταν με την προσθήκη είτε 4-5 μg/mL αντι-TNF-α ή 12-16 μg/mL αντι-IFN-γ ή και των δύο ή μη ειδικού IgG αντισώματος σε 300 μl υπερκείμενου και επώαση στον κλίβανο για 30 λεπτά. Διαπιστώσαμε ότι τα υπερκείμενα ΜΚΠΑ του συνόλου των ασθε-νών με ΧΝΑ προκαλούσαν καταστολή των BFU-E σε σημαντικό βαθμό (BFU-E με υπερκείμενο φυσιολογικών ατόμων= 90±67,35/2x105 κύτ./mL, BFU-E με υπερκείμενο ασθενών= 50,64±36,25/2x105 κυτ./mL, ανάπτυξη 66% του φυσιολογικού, p=0,0006). Ο βαθμός καταστολής δε διέφερε στις υποομάδες των ασθενών που μελετήθηκαν (BFU-E ασθενών χωρίς υποκατάσταση 68% του φυσιολογικού, ασθενείς σε αιμοκάθαρση 63% του φυσιολογικού, ασθενείς σε περιτοναϊκή κάθαρση 66% του φυσιολογικού). Η προσθήκη πολυκλωνικού αντισώματος έναντι του TNF-α ανέστειλε σχεδόν πλήρως την κατασταλτική ικανότητα του υπερκεί-μενου στην ανάπτυξη των BFU-E (BFU-E με υπερκείμενο ασθενών ανά-πτυξη 68% του φυσιολογικού και BFU-E με υπερκείμενο ασθενών + αντι-TNF-α ανάπτυξη 93% του φυσιολογικού, p<0,001). Τα αντισώματα έναντι της IFN-γ δεν είχαν στατιστικά σημαντική επίδραση (p= 0,948). Tα επίπεδα του TNF-α στα υπερκείμενα των ασθενών ήταν στατιστικώς ση-μαντικά αυξημένα (TNF-α ασθενών= 2,23±1,29 ng/mL vs TNF-α ομάδας ελέγχου= 1,55±1,20 ng/mL, p=0,006). Συμπερασματικά, από τα ευρήματα της μελέτης μας προκύπτει ότι: α. τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος των ασθενών με ΧΝΑ τελικού σταδίου παράγουν αυξημένα ποσά TNF-α και καταστέλ-λουν in vitro την ερυθροποίηση β. η καταστολή της ερυθροποίησης είναι ανεξάρτητη της υποβολής ή μη των ασθενών σε υποκατάσταση της νεφρικής λειτουργίας και της μεθόδου υποκατάστασης γ. επιβεβαιώνονται τα ευρήματα της μελέτης των Allen και συν. (1999), οι οποίοι χρησιμοποίησαν στα πειράματα πλάσμα ουραιμικών ασθενών και ανέδειξαν το ρόλο των κυτταροκινών TNF-α και IFN-γ στην καταστολή της ερυθροποίησης των ασθενών με ουραιμία δ. στην παθογένεια της αναιμίας της ΧΝΑ συμμετέχει μερικώς του-λάχιστον ένας εκ των γνωστών μηχανισμών ανάπτυξης της αναιμίας χρόνιας νόσου ε. η καταστολή της ερυθροποίησης πιθανόν να επιτείνεται όταν συνυπάρχει λοίμωξη ή φλεγμονή στ. τα ευρήματά μας ερμηνεύουν εν μέρει το φαινόμενο της αντί-στασης στη χορήγηση rh- ΕΠΟ που εμφανίζουν μερικοί ασθενείς με ΧΝΑ ζ. η θεραπευτική επιλογή της χορήγησης πεντοξυφυλλίνης, που ανα-στέλλει τη δράση των κυτταροκινών, σε ασθενείς με πτωχή ανταπόκριση στη rh-ΕΠΟ, φαίνεται ρεαλιστική.