Μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην εγγραφή πρώιμων εμπειριών στον εγκέφαλο του επίμυ

Abstract

It is generally accepted that early experiences, particularly mother-offspring interactions influence brain development and are of great importance in determining adult behavior. However the cellular and molecular mechanisms underlying the imprinting of early experiences on the brain remain largely unknown. The present work is an attempt to address such issues. We employed the well described experimental paradigm of neonatal handling, which consists of 15 min daily separations of the offspring from their mother during the period of lactation (postnatal days 1-22). Neonatal handling has been shown to affect the programming of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis so that the ability of the organism to cope with novel, stressful stimuli and in general its adaptability is increased throughout life. Among the different brain areas, the hippocampus appears to be particularly affected by neonatal handling. Since the effects of neonatal handling are longlasting and widespread within the brain, this early experience must affect the expression of molecules that play a determining role in brain development, such as transcription factors and neurotrophins. Each transcription factor regulates the expression of many genes, so a change in the levels of one transcription factor may have pleiotropic effects, affecting multiple cellular processes. Neurotrophins on the other hand are peptides which control neuronal division, differentiation, migration, as well as synaptic plasticity. Based on the above we determined the effect of neonatal handling on the levels of neurotrophins BDNF and NT-3, as well as those of the transcription factors p-CREB and c-Fos in the rat hippocampus on postnatal days 1 (2, 4, and 8 hours following handling), 23 and 90 (adult). Neonatal handling resulted in increased levels of all the above molecules 8 hours following handling on the first postnatal day. Interestingly, NT-3 increased first: Handled animals had higher NT-3 levels than the nonhandled 4 hours following handling. In the hippocampus of 23 day old rats BDNF and NT-3 were increased in the CA4 area, due to handling. The handling-induced increase in BDNF was maintained in the adult hippocampus of male animals. An additional interesting result that emerged from this study is that an intraperitoneal saline injection was a stressful stimulus, which resulted in decreased p-CREB and BDNF 2 and 4 hours later, and increased c-Fos, only in the nonhandled animals, 8 hours following the injection. In an effort to elucidate the neurotransmitter receptors and channels mediating the effects of handling we investigated the effect of handling on BDNF, NT-3, p-CREB, and c-Fos in the hippocampus of one day old rats in the presence and absence of NMDA, AMPA/kainate, GABA-A, 5-HT1A, 5-HT2A/C receptor antagonists or an L type voltage gated calcium channel (LVGCC) blocker. Blockade of the above receptors and channels cancelled the handling-induced effects observed 8 hours following handling on the neurotrophins and transcription factors studied. Based on our results we propose that the following mechanism underlies the “imprinting” of the early experience of handling on the developing rat brain: The altered maternal care induced by handling modifies in the offspring sensory stimulation, which activates glutamatergic and GABAergic pathways. AMPA/kainic and GABA-A receptor activation leads to depolarization of the neuronal membrane, and consequent activation of NMDA receptors and LVGCCs, through which calcium ions enter the cell and activate kinases, which in turn activate transcription factors which control the expression of genes coding for morphogenetic factors, such as the neurotrophins.

Είναι γενικώς αποδεκτό ότι οι πρώιμες εμπειρίες, ιδιαίτερα οι αλληλεπιδράσεις μητέρας- νεογνού, επηρεάζουν την ανάπτυξη του εγκεφάλου και είναι μείζονος σημασίας για τον καθορισμό της συμπεριφοράς του ενήλικου οργανισμού. Ωστόσο, οι μοριακοί και κυτταρικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην εγγραφή των πρώιμων εμπειριών στον εγκέφαλο παραμένουν σε μεγάλο βαθμό αδιευκρίνιστοι. Η παρούσα μελέτη αποτελεί προσπάθεια διερεύνησης τέτοιων μηχανισμών: Εφαρμόστηκε το πειραματικό μοντέλο του «νεογνικού χειρισμού» που συνίσταται στη καθημερινή δεκαπεντάλεπτη απομάκρυνση των νεογνών από τη μητέρα τους κατά την περίοδο της γαλουχίας (1η-22η μεταγεννητική ημέρα). Έχει δειχθεί ότι ο νεογνικός χειρισμός επηρεάζει τον προγραμματισμό του υποθαλαμο-υποφυσιακο-επινεφριδιακού άξονα, καθιστώντας τον οργανισμό πιο ικανό να αντεπεξέρχεται σε καινοφανή στρεσσογόνα ερεθίσματα και γενικότερα αυξάνοντας την προσαρμοστικότητά του. Μεταξύ των ποικίλων περιοχών του εγκεφάλου, ο ιππόκαμπος αποτελεί κατ΄εξοχήν στόχο του. Καθόσον ο νεογνικός χειρισμός έχει μακροπρόθεσμες και ευρείες επιπτώσεις στον εγκέφαλο, η συγκεκριμένη πρώιμη εμπειρία θα πρέπει να επηρεάζει την έκφραση μορίων, τα οποία παίζουν καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη του εγκεφάλου, όπως είναι οι παράγοντες μεταγραφής και οι νευροτροφίνες. Κάθε μεταγραφικός παράγοντας ρυθμίζει την έκφραση πλειάδας γονιδίων, ώστε η μεταβολή στα επίπεδα μιας τέτοιας ρυθμιστικής πρωτεΐνης μπορεί να έχει πλειοτροπικές δράσεις, επηρεάζοντας πολλαπλές κυτταρικές διεργασίες. Από την άλλη πλευρά, οι νευροτροφίνες είναι πεπτίδια, τα οποία ελέγχουν την νευρωνική διαίρεση και διαφοροποίηση, τη μετανάστευση νευρώνων καθώς και τη συναπτική πλαστικότητα. Με βάση τα παραπάνω, μελετήσαμε την επίδραση του νεογνικού χειρισμού στα επίπεδα των νευροτροφινών BDNF και NT-3 , καθώς και των παραγόντων μεταγραφής p-CREB και c-Fos στον ιππόκαμπο επίμυων την 1η (2, 4 και 8 ώρες μετά από την έκθεση στο νεογνικό χειρισμό), την 23η και την 90η μεταγεννητική ημέρα. Ο νεογνικός χειρισμός προκάλεσε αύξηση των επίπεδων όλων των παραπάνω πρωτεϊνών κατά την 1η μεταγεννητική ημέρα, 8 ώρες μετά την έκθεση στο νεογνικό χειρισμό. Ενδιαφέρον προκαλεί το γεγονός ότι πρώτα αυξάνονται τα επίπεδα της ΝΤ-3: Τα ζώα που είχαν εκτεθεί σε νεογνικό χειρισμό παρουσίασαν υψηλότερα επίπεδα για τη πρωτεΐνη ΝΤ-3 σε σύγκριση με τα ζώα-μάρτυρες, 4 ώρες μετά την έκθεση στο χειρισμό. Στον ιππόκαμπο επίμυων ηλικίας 23 ημερών παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων για τον ΒDNF και την ΝΤ-3 στην περιοχή CA4, εξαιτίας του χειρισμού. Η προκαλούμενη από τον χειρισμό αύξηση των επιπέδων του BDNF διατηρήθηκε στην περιοχή του ιππόκαμπου και στα ενήλικα αρσενικά πειραματόζωα. Ένα επιπλέον ενδιαφέρον αποτέλεσμα που προέκυψε από αυτή τη διατριβή είναι ότι η ενδοπεριτοναϊκή ένεση φυσιολογικού ορού έδρασε ως στρεσσογόνο ερέθισμα, που οδήγησε 2 και 4 ώρες μετά σε μείωση του p-CREB και του BDNF και σε αύξηση, μόνο στα ζώα που δεν εκτέθηκαν στο νεογνικό χειρισμό, της c-Fos, 8 ώρες μετά την ένεση. Στην προσπάθεια διερεύνησης των υποδοχέων νευροδιαβιβαστών και δίαυλων ιόντων που διαμεσολαβούν τις επιδράσεις του νεογνικού χειρισμού, μελετήσαμε την επίδραση του χειρισμού στα επίπεδα των BDNF, ΝΤ-3, p-CREB και c-Fos στον ιππόκαμπο επίμυων κατά την πρώτη ημέρα μετά τη γέννηση τους παρουσία ή όχι ανταγωνιστών των υποδοχέων NMDA, AMPA/καϊνικού, GABA-A, 5-HT1A ή 5ΗΤ2A/C ή αναστολέων των τασεοεξαρτώμενων διαύλων ασβεστίου (LVGCC). Όταν οι παραπάνω υποδοχείς και ιοντικοί δίαυλοι ήταν σε αναστολή, 8 ώρες μετά την έκθεση στο νεογνικό χειρισμό δεν παρατηρήθηκε επίδραση της νεογνικής αυτής εμπειρίας στα επίπεδα των νευροτροφινών και των παραγόντων μεταγραφής. Με βάση τα αποτελέσματα μας, προτείνεται ότι ο ακόλουθος μηχανισμός ενέχεται στην «εγγραφή» της πρώιμης εμπειρίας του χειρισμού στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο του επίμυ: Η αλλαγή στην μητρική φροντίδα που προκαλείται από τον χειρισμό τροποποιεί την αισθητηριακή διέγερση των νεογνών, η οποία κινητοποιεί γλουταματεργικές και GABA-εργικές οδούς. Η ενεργοποίηση των υποδοχέων AMPA/καϊνικού και GABA-A προκαλεί εκπόλωση της κυτταρικής μεμβράνης με επακόλουθη ενεργοποίηση των υποδοχέων NMDA και των διαύλων LVGCC, μέσω των οποίων εισέρχονται ιόντα ασβεστίου στο εσωτερικό του κυττάρου. Τα ιόντα αυτά συντελούν στην ενεργοποίηση κινασών, οι οποίες με τη σειρά τους ενεργοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες που ελέγχουν την ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων, τα οποία κωδικοποιούν για μορφογενετικούς παράγοντες όπως οι νευροτροφίνες.