Συναπτική δράση παραγώγων νευροδιαβιβαστών και αντιεπιληπτικών φαρμάκων στον εγκέφαλο φυσιολογικών και επιληπτικών πειραματοζώων

Abstract

The aim of the study presented here is to contribute to the investigation of epileptogenesis. The study is divided in three parts. The first part investigates possible mechanisms of inherited epileptogenesis in the epileptic mutant mouse tottering (tg/tg) by examining the following questions: 1) The function of cholinergic system in the cerebral cortex (through determination of the activity and kinetic properties of enzyme ChAT). 2) The physiological neuronal excitability and its changes due to: a) the increase (+2mM) of extracellular Κ⁺, b) the activation of NMDA receptors and c) the application of 10μΜ Adenosine (endogenous substance with antiepileptic properties). Epileptic mice (tg/tg) and phenotypically normal controls (tg/+ or +/+) were used for all the experiments (1 and 2), which employed respectively a radiochemical method (1) and in vitro recordings of field potentials from the pyramidal cells of hippocampal area CA₁ (2). Postsynaptic excitability as expressed by the PS/fEPSP input-output curves was found increased in tg/tg mice as compared to controls. Quantitative differences in the degree of synaptic activation of tg/tg versus controls were proved statistically non significant. Other significant findings irrespectively of epilepsy were: the indication that excitability increases with age during the reproductive period, the long term enhancement of postsynaptic excitability along with the induction of LTP due to NMDA receptor activation, and the independence of LTP induction process, in CA₁ hippocampal area, from any epileptiform activity. The second part is a pharmacological study aiming at the investigation of a possible cellular mechanism of action of six prorotype antiepileptics (Phenytoin, Carbamazepine, Phénobarbital, Ethosuximide, Valproate and Midazolam). The possibility of their exerting their antiepileptic action through NMDA receptor antagonism was examined. The results suggest that this is unlikely, the exception being Midazolam. The project took place by recording field potentials in vitro, from the hippocampal area CA₁ pyramidal cells of Wistar rats. The third part is an ontogenetic study aiming at the investigation of the participation of endogenous adenosine/adenosine receptors in synaptic potentials during CNS maturation. It was performed by recording CA₁ dendritic field potentials from hippocampal slices of Wistar rats aged 5, 10, 15, 20, 30 and 120 days. Synaptic potentials decreased in response to the application of 10μΜ Adenosine already from the age of 5 days and this effect remained quantitatively stable during development. The application of 100μΜ Caffeine (an adenosine competitive antagonist) enhanced the synaptic potentials in all the slices tested at 15, 20 and 30 days while it had no effect on half of the slices tested at 5 and 10 days. This finding indicates lower levels of endogenous adenosine in younger animals. Nitrobenzylthioinosine, an adenosine uptake blocker, at 50μΜ depressed the synaptic potentials and significantly enhanced the action of (exogenous) adenosine at all ages tested. Lower levels of endogenous adenosine in immature tissue might account for the increased excitability and tendency for epileptiform discharges observed during development.

Η εργασία που παρουσιάζεται εδώ είχε σαν σκοπό την έρευνα της επιληπτογένεσης από διαφορετικές πλευρές. Το πρώτο - και μεγαλύτερο - μέρος καλύπτεται από την έρευνα πιθανών μηχανισμών επιληπτογένεσης στο μεταλλαγμένο επιληπτικό ποντίκι tottering (tg/tg), ένα γενετικό μοντέλο μικρής γενικευμένης επιληψίας. Εξετάστηκαν η λειτουργία του χολινεργικού συστήματος στον εγκεφαλικό φλοιό (μέσω προσδιορισμού της δραστικότητας του ενζύμου ChAT), η φυσιολογική διεγερσιμότητα και οι μεταβολές της σαν ανταπόκριση στην αύξηση του εξωκυττάριου Κ⁺ κατά 2mM, στην ενεργοποίηση των NMDA υποδοχέων και την εφαρμογή 10μΜ Αδενοσίνης . Όλα τα πειράματα έγιναν σε επιληπτικά ποντίκια (tg/tg) και φυσιολογικά ομόλογά τους (tg/+ ή +/+), και εκτός από τα αναφερόμενα στο πρώτο ερώτημα, όλα έγιναν με in vitro καταγραφές εξωκυττάριων δυναμικών από τα πυραμιδικά κύτταρα της περιοχής CA₁ του ιπποκάμπου. Η φυσιολογική μετασυναπτική διεγερσιμότητα όπως εκφράζεται από τις αντίστοιχες καμπύλες βρέθηκε αυξημένη στα επιληπτικά ποντίκια, ενώ οι διαφορές μεταξύ επιληπτικών και φυσιολογικών ποντικιών στο βαθμό της συναπτικής ενεργοποίησης και στα επιμέρους ερωτήματα που τέθηκαν δεν βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές. Συμπεραίνεται ότι η επιληπτογόνος προδιάθεση στα ποντίκια tottering δεν σχετίζεται απαραίτητα, αλλά οπωσδήποτε κληρονομείται με μια αύξηση της νευρωνικής διεγερσιμότητας στον ιππόκαμπο. Ο μηχανισμός της τελευταίας αφορά την ικανότητα των νευρώνων να παρουσιάζουν δυναμικά ενέργειας και όχι τους συγκεκριμένους μηχανισμούς συναπτικής διαβίβασης που μελετήθηκαν. Ανεξάρτητα από την παραπάνω μελέτη ορισμένα σημαντικά ευρήματα που προέκυψαν είναι: 1 ) Η ένδειξη ότι η διεγερσιμότητα αυξάνει με την πάροδο της ηλικίας, όταν η τελευταία βρίσκεται ακόμη μέσα στα αναπαραγωγικά όρια, 2) η μεγάλης διάρκειας αύξηση της μετασυναπτικής διεγερσιμότητας που συνοδεύει την πρόκληση μακρόχρονης ενίσχυσης της συναπτικής απάντησης (LTP) μετά από ενεργοποίηση των NMDA υποδοχέων και 3) η πρόκληση LTP στην περιοχή CA₁ του ιππόκαμπου ανεξάρτητα από τυχόν επιληπτοειδή ηλεκτρική δραστηριότητα. Τα δύο επόμενα μέρη έχουν σαν έμμεσο ή απώτερο σκοπό τη διερεύνηση της επιληπτογένεσης και έγιναν με in vitro καταγραφές εξωκυττάριων δυναμικών από τα πυραμιδικά κύτταρα της περιοχής CA₁ του ιππόκαμπου αρουραίων (Wistar). Το δεύτερο μέρος αποτελείται από μια φαρμακολογική μελέτη με στόχο τη διερεύνηση του κυτταρικού μηχανισμού δράσης έξι πρότυπων αντιεπιληπτικών φαρμάκων (Φαινυτοϊνη, Καρβαμαζεπίνη, Φαινοβαρβιτάλη, Εθοσουξιμίδη, Βαλπροϊκό και Μινταζολάμ). Εξετάστηκε η πιθανότητα άσκησης της αντιεπιληπτικής δράσης αυτών των ουσιών μέσω ανταγωνισμού των NMDA υποδοχέων. Η πιθανότητα αυτή αποκλείστηκε για όλες τις ουσίες πλην του Μινταζολάμ. Το τρίτο μέρος αποτελείται από μία οντογενετική μελέτη με στόχο τη διερεύνηση της συμμετοχής ενός ενδογενούς αντίεπιληπτικού - όπως έχει χαρακτηρισθεί η Αδ - στις φυσιολογικές λειτουργίες κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης του Κ.Ν.Σ. και έγινε με in vitro καταγραφές εξωκυττάριων δυναμικών από τα πυραμιδικά κύτταρα της περιοχής CA₁ του ιππόκαμπου αρουραίων (Wistar) ηλικίας 5, 10, 15, 20, 30 και 120 ημερών. Η ανταπόκριση σε 10μΜ εξωγενούς Αδενοσίνης, 100μΜ Καφεΐνης και 50μΜ Νιτροβενζυλθειοϊνοσίνης βρέθηκε σταθερή κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, ενώ η έλλειψη φαρμακολογικής δράσης της Καφεΐνης στις μισές από τις τομές 5 και 10 ημερών που εξετάστηκαν δηλώνει χαμηλώτερα επίπεδα ενδογενούς Αδενοσίνης στις μικρές ηλικίες. Το εύρημα αυτό δίνει μια πιθανή εξήγηση για την αυξημένη διεγερσιμότητα και τάση για επιληπτογένεση που παρουσιάζεται σ' αυτές τις ηλικίες .