Μοριακές συνιστώσες στην αιτιοπαθογένεια του σακχαρώδους διαβήτη τύπου 1

Abstract

Introduction: Type 1 Diabetes Mellitus (T1DM) is a genetically complex disorder that results from the destruction of the insulin-secreting β-cells of the pancreas. It has been proposed that the disease is caused by environmental factors operating in a genetically susceptible individual to initiate a destructive autoimmune process. The autoimmune reactions are pronounced at the onset of the disease. The importance of the role of environmental factors in the pathogenesis of the disease is stressed by the observed North to South gradient in the incidence of T1DM in Europe. During the past decade the genetics of T1DM has been studied extensively and the disorder has become a paradigm for the genetic dissection of complex traits. Three major approaches have been developed: linkage analysis, affected sib-pair analysis and association studies. Previous genome screens and studies focused on candidate genes have provided evidence for genetic linkage between polymorphic DNA markers and 18 putative IDDM susceptibility loci, designated IDDM1-IDDM18. The HLA region (IDDM1) is thought to be the major genetic determinant of disease susceptibility. DQB1 and DQA1 have been shown to play a primary role. However HLA is supposed to contain more loci of diabetes susceptibility. For instance there is evidence of an independent effect of DRB1 on T1DM risk. Here we used association studies in the Greek population to investigate the role of the HLA genes in T1DM. Furthermore a HLA-based screening strategy was designed and evaluated, that could be applicable to the Greek population. Data from our population was then compared with similar data from the Finnish population, where the incidence of T1DM is the highest in Europe. Finally we carried out a screen of all autosomomes for linkage with the disease using a microsatellite genetic. Materials and Methods: Cord blood samples from 1842 Greek newborns as well as samples from 131 Greek individuals with T1DM were initially typed for 6 HLA-DQB1 alleles, using a method that utilizes time-resolved fluorometry to detect the hybridization of lanthanide labelled oligonucleotides with PCR products. In selected cases a second step of typing for HLA-DQA1 or DR4 followed. Relative risk conferred by each genotype was calculated and χ2 tests and t-tests were used for the statistical analysis. The genome screening was conducted on 19 families of Greek origin with two affected sibs. We used a microsatellite genetic map spanning the genome and semi-automated fluorescent based genotyping technology. The data was analysed my nonparametric linkage methods. Results: We confirm the strong association of DQB1 and DQA1 alleles with T1DM in the Greek population and also demonstrate the independent effect of DR4 subtypes on T1DM risk. We found that population distribution of DQB1, DQA1 and DRB1 alleles correlates with the differences in the observed incidence difference between Greece and Finland. In addition a two-step screening strategy involving DQB1, DQA1 and DRB1 alleles, was found to be powerful in T1DM prediction in the Greek population. The genome screen provided evidence that confirms linkage of T1DM in the Greek population with loci already reported in previous genome scans, but also suggests linkage with loci that have not been reported before but may be important in our population. Conclusions: We emphasized the independent diabetogenic role of DQB1, DQA1 and DRB1 genes in the Greek population. Furthermore we described a simple strategy for the screening of T1DM development risk that could be easily applied in the Greek population. We also established a possible genetic basis for the observed incidence difference between Greece and Finland. Finally our genome screening, despite the modest sample size, provided suggestive evidence for possible new T1DM linked loci in the Greek population

Εισαγωγή: Ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου 1 (Σ.Δ.Τ. 1) αποτελεί μια γενετικά ετερογενή νόσο, η οποία προκαλείται από τη δράση περιβαλλοντικών παραγόντων σε γενετικά προδιατεθειμένα άτομα προκαλώντας την έναρξη μιας καταστροφικής αυτοάνοσης διεργασίας. Η σημασία του ρόλου των περιβαλλοντικών παραγόντων στην παθογένεια της νόσου υπογραμμίζεται από την κλιμάκωση από Βορρά προς Νότο της επίπτωσης του Σ.Δ.Τ. 1 στην Ευρώπη. Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας η γενετική του Σ.Δ.Τ. 1 μελετήθηκε εντατικά και η νόσος έγινε παράδειγμα για τη γενετική διερεύνηση των πολυπαραραγοντικών νόσων. Αναπτύχθηκαν τρεις κύριες προσεγγίσεις: Η ανάλυση σύνδεσης, η ανάλυση ζεύγους προσβεβλημένων αδελφών και οι μελέτες συσχέτισης. Προηγούμενες ανιχνεύσεις του γονιδιώματος και μελέτες σε υποψήφια γονίδια έχουν δώσει αποδείξεις για γενετική σύνδεση μεταξύ δεικτών DNA και τουλάχιστον 18 πιθανών τόπων προδιάθεσης για το Σ.Δ.Τ. 1 οι οποίοι ονομάστηκαν IDDM1-IDDM18. Η περιοχή του HLA (IDDM1) πιστεύεται ότι αποτελεί τον κύριο γενετικό προσδιοριστή της νόσου. Τα γονίδια DQB1 και DQA1 έχει δειχθεί ότι παίζουν πρωταρχικό ρόλο. Ωστόσο το HLA πρέπει να περιέχει και άλλους τόπους προδιάθεσης. Για παράδειγμα υπάρχουν ενδείξεις για την ανεξάρτητη δράση του DRB1 στον κίνδυνο για το Σ.Δ.Τ. 1. Στη μελέτη αυτή χρησιμοποιήσαμε μελέτες συσχέτισης στον ελληνικό πληθυσμό προκειμένου να διερευνήσουμε το ρόλο των γονιδίων του HLA στο Σ.Δ.Τ. 1. Επιπλέον σχεδιάστηκε και αξιολογήθηκε μια στρατηγική ανίχνευσης της γενετικής προδιάθεσης του Σ.Δ.Τ. 1, η οποία θα μπορούσε να εφαρμοστεί στον ελληνικό πληθυσμό. Τα δεδομένα από τον πληθυσμό μας συγκρίθηκαν με αντίστοιχα από τον πληθυσμό της Φινλανδίας, όπου παρατηρείται η υψηλότερη επίπτωση Σ.Δ.Τ. 1 στην Ευρώπη. Τέλος έγινε μια σάρωση των αυτοσωμικών χρωμοσωμάτων για σύνδεση με το Σ.Δ.Τ. 1. Υλικά και Μέθοδος: Μελετήθηκαν δείγματα αίματος από 131 άτομα με διαβήτη και 1842 δείγματα ελέγχου από ομφάλιο λώρο νεογνών. Αρχικά έγινε τυποποίηση για έξι αλληλόμορφα του HLA-DQB1 με τη μέθοδο της φθοριομετρίας χρονικού διαχωρισμού, η οποία ανιχνεύει τον υβριδισμό ολιγονουκλεοτιδίων σημασμένων με λανθανίδες με προϊόντα PCR. Σε επιλεγμένες περιπτώσεις ακολούθησε ένα δεύτερο βήμα τυποποίησης για HLA-DQA1 ή DR4. Υπολογίστηκε ο σχετικός κίνδυνος που αποδίδεται από κάθε γονότυπο και χρησιμοποιήθηκαν οι δοκιμασίες χ2 και t-test για τη στατιστική επεξεργασία. Η σάρωση του γονιδιώματος έγινε σε 19 οικογένειες ελληνικής καταγωγής με δύο προσβεβλημένα παιδιά. Χρησιμοποιήθηκε χάρτης μικροδορυφόρων που εκτείνεται σε ολόκληρο το γονιδίωμα και τεχνολογία ημι-αυτόματης γονοτυποποίησης βασισμένη στο φθορισμό. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με μη παραμετρικές μεθόδους. Αποτελέσματα: Επιβεβαιώθηκε η ισχυρή συσχέτιση των αλληλομόρφων του DQB1 και DQA1 με το Σ.Δ.Τ. 1 στον ελληνικό πληθυσμό και επιπλέον υποδεικνύουμε την ανεξάρτητη δράση των υποτύπων του DR4 στον κίνδυνο για Σ.Δ.Τ. 1. Δείχθηκε ότι η κατανομή στον πληθυσμό των αλληλομόρφων DQB1, DQA1 και DRB1 συμβαδίζει με την παρατηρούμενη διαφορά στην επίπτωση του Σ.Δ.Τ. 1 ανάμεσα σε Ελλάδα και Φινλανδία. Επιπλέον μια στρατηγική ανίχνευσης, η οποία περιλαμβάνει δύο βημάτα και τυποποίηση των αλληλομόρφων DQB1, DQA1 και DRB1 αποδείχτηκε αποτελεσματική για την πρόβλεψη του Σ.Δ.Τ. 1 στον ελληνικό πληθυσμό. Η σάρωση του γονιδιώματος επιβεβαιώνει τη σύνδεση του Σ.Δ.Τ. 1 στις οικογένειες που μελετήθηκαν με τόπους που έχουν αναφερθεί σε προηγούμενες μελέτες. Επιπλέον παρέχει ενδέιξεις για καινούριους τόπους που πιθανό να παίζουν σημαντικό ρόλο στον ελληνικό πληθυσμό. Συμπεράσματα: Υπογραμμίστηκε ο ανεξάρτητος διαβητογόνος ρόλος των γονιδίων DQB1, DQA1 και DRB1 στον ελληνικό πληθυσμό. Επιπλέον περιγράφηκε μια απλή στρατηγική ανίχνευσης του κινδύνου για Σ.Δ.Τ. 1, η οποία θα μπορούσε με ευκολία να εφαρμοστεί στον ελληνικό πληθυσμό. Δόθηκαν ενδείξεις για την ύπαρξη γενετικής βάσης στην παρατηρούμενη διαφορά στην επίπτωση της νόσου ανάμεσα σε Ελλάδα και Φινλανδία. Τέλος η σάρωση του γονιδιώματος, παρά το μικρό μέγεθος του δείγματος, έδωσε ενδείξεις για πιθανούς νέους τόπους προδιάθεσης του Σ.Δ.Τ. 1 στον ελληνικό πληθυσμό