Μελέτη της έκφρασης γονιδίων φαρμακευτικής αντοχής στην παιδική λευχαιμία

Abstract

Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common childhood malignancy. Despite the progress that has been achieved in treatment of childhood ALL a significant percentage of children will eventually relapse. Treatment failure in these patients is mainly attributable to the occurrence of resistance to structurally and functionally unrelated drugs, called multidrug resistance (MDR). The major mechanism is the overexpression of multi drug resistance gene (MDR1), the multi drug resistance related protein gene (MRP1), the breast cancer resistance protein (BCRP) and the lung resistance gene (LRP) which encode proteins acting as drug efflux pumps resulting in low intracellular accumulation of chemotherapeutic drugs. Aim of this prospective study was the analysis of expression of mRNA of genes implicated in the mechanism of multidrug resistance such as MDR1, MRP1, BCRP and LRP in relation with response to induction chemotherapy and relapse and their correlation with each other as well as with pre-treatment laboratory and clinical characteristics. Material and methods: We studied prospectively 49 children with ALL (26 boys and 23 girls) with median age of 5.5 years (range: 15 months to 12.5 years), treated with the BFM95 chemotherapy protocol. As controls we used bone marrow (BM) mononuclear cells from 7 children who underwent a BM biopsy for diagnostic purposes and was negative for leukemia. Total RNA was isolated from BM samples at initial diagnosis with an excess of 90% leukemic blasts and relapse. The expression of MDR-genes and the housekeeping b-actin gene was detected by RT-PCR using the appropriate primers. The relative mRNA expression of each MDR-gene was calculated using the following formula: Expression Index (EI): MDR-gene product / b-actin PCR product. Results: Statistically significant correlation was found between the EI of MRP or LRP with each other and MDR1 (p<0.05). We found significantly higher mean EI for MDR1 at relapse at four paired samples compared with diagnosis. High EI for the MDR1 gene was found in 18 patients (36.7%) and their prognosis was significantly worse compared with those with low EI ((Event free survival (EFS): 55.56% vs 86.67%, p log rank=0.03). High MDR1 gene expression was independent of initial white blood cell (wbc) count, immunophenotype, NCI and BFM risk classification. Conclusions: The expression of the MDR1 gene is a biologic marker helpful in predicting the risk of treatment failure and it is useful to be evaluated along with the other prognostic factors.

H οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ) είναι η συχνότερη κακοήθης νόσος της παιδικής ηλικίας. Παρά τη μεγάλη πρόοδο που έχει σημειωθεί στη θεραπεία της, ένα σημαντικό ποσοστό παιδιών θα εμφανίσει υποτροπή μετά από την αρχική εισαγωγή σε ύφεση. Αυτό σε ένα μεγάλο ποσοστό αποδίδεται στην εμφάνιση αντοχής των κακοηθών κυττάρων στους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες που αποκαλείται πολυφαρμακευτική αντοχή (multidrug resistance, MDR). Ο κυριότερος μηχανισμός της είναι η υπερέκφραση των γονιδίων MDR1 (Multidrug Resistance 1), MRP1 (Multiple Resistance Protein 1 , BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) και LRP (Lung Resistance Protein) που κωδικοποιούν πρωτεΐνες του κυτταροπλάσματος ή του πυρήνα οι οποίες δρουν ως ενεργητικές αντλίες αποβολής τοξικών μεταβολιτών κυτταροτοξικών φαρμάκων, με τελικό αποτέλεσμα την ελαττωμένη ενδοκυττάρια συγκέντρωση των χημειοθεραπευτικών. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της γονιδιακής έκφρασης μεταγραφημάτων (mRNA) των γονιδίων MDR1, MRP1, LRP, και BCRP σε παιδιά με ΟΛΛ και η συσχέτιση των επιπέδων έκφρασής τους με τους καθιερωμένους προγνωστικούς παράγοντες, την ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία ή την εμφάνιση πρώιμης υποτροπής. Υλικό και μέθοδος: Την ομάδα μελέτης αποτέλεσαν συνολικά 49 παιδιά, 23 κορίτσια και 26 αγόρια, διάμεσης ηλικίας 5,5 έτη (εύρος: 15μηνών έως 12,5 ετών) με ΟΛΛ που έλαβαν το χημειοθεραπευτικό πρωτόκολλο BFM95. Την ομάδα ελέγχου αποτέλεσαν 7 παιδιά τα οποία υποβλήθηκαν σε διαγνωστική οστεομυελική βιοψία που απέβει φυσιολογική. Η έκφραση του mRNA των υπό μελέτη γονιδίων και της β-ακτίνης ως εσωτερικός μάρτυρας μελετήθηκε σε μονοπύρηνα κύτταρα του μυελού με την αντίστροφης-τρανσκριπτάσης αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) και κατάλληλους εκκινητές. Η έκφραση των γονιδίων μελετήθηκε με ηλεκτρονικό πρόγραμμα βάσει της έντασης φθορισμού σε UV ακτινοβολία μετά από ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) σε πηκτή αγαρόζης 1,5% με βρωμιούχο αιθιδίο. Ως δείκτης έκφρασης (ΔΕ) των MDR-γονιδίων ορίστηκε το πηλίκο της έντασης του DNA καθενός από τα υπό μελέτη γονίδια προς αυτό της β-ακτίνης. Αποτελέσματα: Βρέθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση (p<0,05) μεταξύ του ΔΕ των ΜRP1 και LRP μεταξύ τους καθώς και με το MDR1 γονίδιο. Η μέση τιμή του ΔΕ για το MDR1 γονίδιο ήταν στατιστικώς σημαντικά υψηλότερη στα 4 ζεύγη δειγμάτων κατά την υποτροπή σε σχέση με τη διάγνωση. Δεκαοχτώ ασθενείς (36,8%) με υψηλό ΔΕ για το MDR1 γονίδιο είχαν στατιστικώς σημαντικά δυσμενέστερη πρόγνωση σε σχέση με αυτούς με χαμηλό ΔΕ [Ποσοστό ελεύθερης νόσου επιβίωσης 86,67% και 55,56%, αντίστοιχα (p log rank: 0,03)]. Η υψηλή έκφραση του MDR1 γονιδίου δε σχετιζόταν με τον αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων, τον ανοσοφαινότυπο, και την κατάταξη σε ομάδες κινδύνου κατά NCI. Συμπεράσματα: Η μελέτη του MDR1 γονιδίου η έκφραση του οποίου επηρεάζει την πρόγνωση των παιδιών με ΟΛΛ αποτελεί ένα βιολογικό δείκτη που βοηθά στην εκτίμηση του κινδύνου θεραπευτικής αποτυχίας και είναι χρήσιμο να συνεκτιμάται μαζί με τους υπόλοιπους προγνωστικούς παράγοντες.