Βιομετασχηματισμοί φυσικών αντιοξειδωτικών σε ιοντικά υγρά

Abstract

The present study focuses on the development of a novel biocatalytic process for the modification of the structure of natural antioxidants, employing “green”, environmentally friendly and non toxic ionic liquids as reaction media. The enzymatic modification of natural antioxidants is performed through acylation reactions catalyzed by the “work horses” of biotechnology, i.e. lipases, aiming at the synthesis of lipophilic derivatives of natural antioxidants. The importance of the feasibility of this biocatalytic process lies not only in the synthesis of lipophilic biologically active derivatives of natural antioxidants which can be applied in pharmaceutical, cosmetic and food industries, but also in the clarification and understanding of the catalytic properties and structure-function relationships of lipases in this novel category of non-conventional media. In this sense, the thermal stability of two microbial lipases, lipase B from Candida antarctica and lipase from Rhizomucor miehei, was studied in several imidazolium based BF4 - - or PF6 --containing ionic liquids. The study shows that the use of ionic liquids results in the stabilization or even, in some cases, activation of the used lipases. The significant stabilization of lipases in ionic liquids is considered to be highly advantageous, especially in comparison to conventional organic solvents widely employed for the modification of natural compounds, such as antioxidants. Several parameters, such as the type of enzyme preparation (immobilized, lyophilized or free), type of immobilization carrier, incubation temperature, water content and ionic liquid nature, were found to affect lipase stability in ionic liquids. The ionic composition of ionic liquids imposes a considerable effect, as in all cases stability was improved with the elongation of the alkyl chain of imidazolium cation and in the presence of PF6 - as compared to the BF4 - anion. This result can be attributed to the significant effect of different ionic liquids, depending on their properties (hydrophobicity, hydrogen bond basicity, nucleophilicity), on both the water layer surrounding the enzyme molecules as well as their direct effect on enzyme conformation. As the latter effect is still not well described in literature, several spectroscopic techniques (FTIR, fluorescence) were employed and it was found that structural modifications imposed by ionic liquids strongly correlate to lipase stability in these novel media. Since the use of ionic liquids proved to be advantageous in terms of lipase stability, further studies focused on their use as reaction media for the lipase-catalyzed synthesis of lipophilic derivatives of several natural antioxidants (polyphenolic compounds, vitamins and other antioxidants). Results showed that imidazolium based BF4 -- or PF6 --containing ionic liquids can effectively be employed for the biocatalytic modification of several natural antioxidants. In most cases, the use of ionic liquids resulted in significantly higher conversion yields, reaction rates and increased regio-selectivity as compared to conventional organic solvents widely employed for the modification of natural antioxidants. Moreover, using ionic liquids the enzymatic synthesis of several novel bioactive compounds is described, such as hybrid antioxidants of phenolic glucosides and vitamins. Several reaction parameters (nature and concentrations of substrates, origin and amount of lipase, nature of ionic liquid, etc) were found to impose a significant effect on the performance of the aforementioned enzymatic modification. Among these parameters, the solubility of both substrate and products, which strongly depends upon the nature of ionic liquid used, significantly affects the performance of the biocatalytic reactions. The use of ionic liquids as reaction media resulted in the synthesis of great amounts of lipophilic derivatives in a single step biocatalytic process. More importantly, under optimum conditions, the amount of synthesized derivatives of natural antioxidants was up to eight-fold higher, as compared to organic solvents. In order to define optimum conditions response surface methodology (RSM) was employed. In addition, RSM proved to be an efficient tool for studying the interaction between selected reaction parameters and also for modeling the effect of these parameters. Finally, the enzymatically synthesized lipophilic derivatives of natural antioxidants were isolated and their biological activities were investigated through their ability to act as inhibitors of xanthine oxidase and lipoxygenase. These studies revealed that synthesized hybrid antioxidants of vitamins with lipoic acid maintain the inhibitory activity of unmodified vitamins and that ferulic acid lipophilic derivatives show significantly enhanced inhibitory activity as compared to the unmodified compound.

Σκοπό της παρούσας μελέτης αποτελεί η ανάπτυξη μίας βιοκαταλυτικής διεργασίας για την τροποποίηση της δομής διαφόρων φυσικών αντιοξειδωτικών σε μία νέα πολλά υποσχόμενη κατηγορία περιβαλλοντικά φιλικών, χαμηλής τοξικότητας μέσων, τα ιοντικά υγρά. Η τροποποίηση εστιάζει στην αύξηση του λιπόφιλου χαρακτήρα των ενώσεων αυτών, και πραγματοποιείται μέσω αντιδράσεων ακυλίωσης με την εφαρμογή μικροβιακών λιπασών. Η σημασία μίας αποτελεσματικής βιοκαταλυτικής διεργασίας για την τροποποίηση φυσικών αντιοξειδωτικών σε ιοντικά υγρά, έγκειται όχι μόνο στη σύνθεση λιπόφιλων παραγώγων των φυσικών αντιοξειδωτικών με εφαρμογές στις βιομηχανίες τροφίμων, φαρμάκων και καλλυντικών, αλλά και στην βαθύτερη κατανόηση των καταλυτικών ιδιοτήτων και της σχέσης δομής – λειτουργίας των λιπασών στα νέα αυτά μέσα. Αρχικά μελετήθηκε η σταθερότητα δύο λιπασών, της λιπάσης Β από Candida antarctica και της λιπάσης από Rhizomucor miehei, σε διάφορα ιμιδαζολικά ιοντικά υγρά με ανιόντα BF4 - ή PF6 - . Η μελέτη έδειξε πως η επώαση των ενζύμων σε ιοντικά υγρά οδηγεί σε σημαντική σταθεροποίηση ή ακόμα και σε αύξηση της δραστικότητάς τους. Το γεγονός αυτό καταδεικνύει ένα σαφές πλεονέκτημα της εφαρμογής των ιοντικών υγρών έναντι των συμβατικών οργανικών διαλυτών που χρησιμοποιούνται ευρέως για την επίτευξη της ενζυμικής τροποποίησης φυσικών βιοδραστικών ενώσεων, όπως των φυσικών αντιοξειδωτικών. Στη σταθερότητα των λιπασών σε ιοντικά υγρά επιδρά σημαντικά το είδος του ενζυμικού σκευάσματος, η φύση του φορέα ακινητοποίησης, η θερμοκρασία επώασης, το περιεχόμενο στο μέσο νερό και η φύση του ιοντικού υγρού. Η φύση του ιοντικού υγρού ασκεί σημαντική επίδραση, καθώς σε όλες τις περιπτώσεις, η αύξηση της αλκυλικής αλυσίδας του ιμιδαζολικού κατιόντος και η παρουσία του PF6 - ανιόντος οδήγησε σε αύξηση της σταθερότητας. Τα αποτελέσματα αυτά αποδόθηκαν στις διαφορετικές ιδιότητες των ιοντικών υγρών (υδροφοβικότητα, βασικότητα δεσμών υδρογόνου, πυρηνοφιλικότητα), οι οποίες εξαρτώνται από τη φύση των ιόντων του ιοντικού υγρού. Οι ιδιότητες αυτές καθορίζουν την αλληλεπίδραση του ιοντικού υγρού με το απαραίτητο στρώμα νερού που περιβάλλει το ένζυμο αλλά και την άμεση επίδρασή του στην ενζυμική δομή. Η άμεση αυτή επίδραση μελετήθηκε μέσω φασματοσκοπικών τεχνικών, όπως FTIR και φθορισμός, και παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των δομικών μεταβολών των λιπασών και της σταθερότητάς τους σε ιοντικά υγρά. Στη συνέχεια μελετήθηκε η δυνατότητα χρήσης των ιοντικών υγρών ως μέσων για την καταλυόμενη από λιπάσες σύνθεση λιπόφιλων παραγώγων διαφόρων φυσικών αντιοξειδωτικών, όπως φλαβονοειδών, φαινολικών γλυκοσιδίων, φαινολικών οξέων και βιταμινών. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν πως ιμιδαζολικά ιοντικά υγρά με ανιόντα BF4 - ή PF6 - αποτελούν, στις περισσότερες περιπτώσεις, ιδανικά μέσα για την ενζυμική τροποποίηση των φυσικών αντιοξειδωτικών. Στην πλειοψηφία των περιπτώσεων η χρήση των ιοντικών υγρών οδήγησε σε σημαντικά υψηλότερες αποδόσεις, αρχικές ταχύτητες και σε αυξημένη τόπο-εκλεκτικότητα, συγκριτικά με οργανικούς διαλύτες που χρησιμοποιούνται ευρέως για την τροποποίηση φυσικών αντιοξειδωτικών. Επιπρόσθετα, με την χρήση των ιοντικών υγρών ως μέσων κατέστη δυνατή η σύνθεση νέων βιοδραστικών παραγώγων, όπως υβριδικών αντιοξειδωτικών βιταμινών και φαινολικών γλυκοσιδίων. Ποικίλες παράμετροι (φύση και συγκέντρωση υποστρωμάτων, προέλευση και ποσότητα λιπάσης, φύση του ιοντικού υγρού κ.α.) βρέθηκαν να επιδρούν στην πορεία των βιοκαταλυτικών αντιδράσεων τροποποίησης φυσικών αντιοξειδωτικών. Μεταξύ αυτών, η διαλυτότητα τόσο του αντιοξειδωτικού όσο και των συντιθέμενων προϊόντων, η οποία εξαρτάται από τη φύση του ιοντικού υγρού, επιδρά σημαντικά στην απόδοση των ενζυμικών αντιδράσεων. Η χρήση των ιοντικών υγρών ως μέσων, οδήγησε στη σύνθεση λιπόφιλων παραγώγων σε κλίμακα γραμμαρίου, μέσω μίας βιοκαταλυτικής διεργασίας ενός και μόνου βήματος. Είναι σημαντικό, πως υπό βέλτιστες συνθήκες η ποσότητα των συντιθέμενων παραγώγων σε ιοντικά υγρά είναι αυξημένη έως και 8 φορές συγκριτικά με οργανικούς διαλύτες. Προκειμένου να καθοριστούν οι βέλτιστες συνθήκες εφαρμόσθηκε η μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης (RSM). Η RSM αποδείχθηκε αποτελεσματική και για τη μελέτη της αλληλεπίδρασης μεταξύ επιλεγμένων παραμέτρων αλλά και για τη μοντελοποίηση της επίδρασης των παραμέτρων στην απόδοση των ενζυμικών αντιδράσεων. Τέλος, επιλεγμένα ενζυμικά συντιθέμενα, λιπόφιλα παράγωγα φυσικών αντιοξειδωτικών απομονώθηκαν από τα ιοντικά υγρά και η βιολογική τους δράση μελετήθηκε μέσω της ικανότητας αναστολής της δράσης των οξειδωτικών ενζύμων, οξειδάση της ξανθίνης και λιποξυγονάση. Τα αποτελέσματα των μελετών κατέδειξαν πως υβριδικά αντιοξειδωτικά των βιταμινών με το λιποϊκό οξύ διατηρούν την ανασταλτική δράση των πρόδρομων βιταμινών και πως οι εστέρες του φερουλικού οξέος επιδεικνύουν σημαντικά αυξημένη ανασταλτική δράση συγκριτικά με το μη τροποποιημένο υπόστρωμα.