Χαρακτηρισμός νέων αυτοαντιγόνων του πυρήνα

Abstract

Detection of autoantibodies giving nuclear rim pattern by immunofluorescence (anti-nuclear envelope antibodies - ANEA) in sera from patients with primary biliary cirrhosis (PBC) is a useful tool for the diagnosis and prognosis of the disease. Differences in the prevalence of ANEA in PBC sera so far reported have been attributed to the methodology used for the detection as well as to ethnic/geographical variations. Therefore, we evaluated the prevalence of ANEA in sera of Greek patients with PBC by using methods widely used by clinical laboratories and a combination of techniques and materials. We screened 103 sera by immunoblotting on nuclear envelopes and indirect immunofluorescence (IIF) using cells and purified nuclei. Reactivities against specific autoantigens were assessed using purified proteins, ELISA, immunoprecipitation and mass spectrometry. We found higher prevalence of ANEA when sera were assayed by IIF on purified nuclei or cultured cells (50%) compared to Hep2 commercially available slides (15%). Anti-gp210 antibodies were identified in 22.3% and 33% of sera using ELISA for the C-terminal of gp210 or both ELISA and immunoprecipitation, respectively. Immunoblotting on nuclear envelopes revealed that immunoreactivity for the 210 kDa zone is related to antigp210 antibodies (p<0.0001). Moreover, we found that sera had antibodies for lamins A (6.8%), B (1%) and C (1%) and LBR (8.7%), whereas none at all had detectable anti-p62 antibodies. The prevalence of ANEA or anti-gp210 antibodies is under-estimated in PBC sera which are analyzed by conventional commercially available IIF or ELISA, respectively. Therefore, new substrates for IIF and ELISA should be included by clinical laboratories in the analysis of ANEA in autoimmune sera.

Η ανίχνευση αυτοαντισωμάτων στον ορό ασθενών παίζει κεντρικό ρόλο για τη σωστή διάγνωση και κατάταξη των αυτοάνοσων νοσημάτων. Τόσο σε ερευνητικά όσο και κλινικά εργαστήρια χρησιμοποιούνται οι τεχνικές του έμμεσου ανοσοφθορισμού, της ELISA και της ανοσοαποτύπωσης. Δεδομένης της μεγάλης απόκλισης που παρουσιάζουν δημοσιευμένες μελέτες όσον αφορά στη συχνότητα εμφάνισης αυτοαντισωμάτων του πυρήνα σε ορούς ασθενών με PBC, κύριος στόχος της μελέτης αυτής ήταν να εδραιώσουμε, να χρησιμοποιήσουμε και να συγκρίνουμε όλες τις διαθέσιμες τεχνικές για τον προσδιορισμό αυτοαντισωμάτων του πυρήνα. Για τον σκοπό αυτό α) εδραιώσαμε αρχικά μια μεθοδολογία ανίχνευσης των αντισωμάτων με έμμεσο ανοσοφθορισμό και ταυτοποίησης αυτοαντισωμάτων για συγκεκριμένα αντιγόνα του πυρηνικού φακέλου με βιοχημικές και ανοσοχημικές προσεγγίσεις, χρησιμοποιώντας νέα υποστρώματα και υλικά και β) προσδιορίσαμε τη συχνότητα εμφάνισης αυτοαντισωμάτων για αντιγόνα του πυρήνα και του πυρηνικού φακέλου σε 103 ορούς ασθενών με PBC. Τα σημαντικότερα συμπεράσματα της μελέτης μας είναι τα παρακάτω: 1. Ο έμμεσος ανοσοφθορισμός είναι μια εξαιρετικά αποτελεσματική τεχνική για την ανίχνευση περιπυρηνικών αυτοαντισωμάτων υπό την προϋπόθεση ότι χρησιμοποιούνται κατάλληλα υποστρώματα και αντιδραστήρια. Η χρησιμοποίηση καθαρών πυρήνων χωρίς την παρουσία καταλοίπων του κυτταροπλάσματος, μεθοδολογία εξαιρετικά ευαίσθητη, ειδική και ευκόλως χρησιμοποιούμενη, έδειξε ότι η συχνότητα περιπυρηνικών αυτοαντισωμάτων στη PBC είναι υψηλή και αντιστοιχεί περίπου στο 50% των ασθενών. Επίσης, στη πλειοψηφία των ορών συνυπάρχουν περιπυρηνικά αυτοαντισώματα τάξης IgG και IgM, ενώ τα αντι-κεντρομεριδιακά και τα αντι-sp100 είναι κατά κύριο λόγο ανοσοσφαιρίνες G τάξης. 2. Η ήδη υπάρχουσα και εμπορικά διαθέσιμη μεθοδολογία ELISA δεν επαρκεί για τον προσδιορισμό αντι-gp210 αυτοαντισωμάτων. Ως εκ τούτου, θεωρούμε αναγκαία την ανάπτυξη μεθοδολογίας με νέα αντιγονικά υποστρώματα και δευτερογενή αντισώματα. 3. Η ανοσοαποτύπωση μόνη της ή σε συνδυασμό με την ανοσοκατακρήμνιση αποτελούν αποτελεσματικές μεθόδους για την ανίχνευση αυτοαντισωμάτων για συγκεκριμένες πρωτεΐνες του πυρηνικού φακέλου. Με ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας εκχυλίσματα πυρηνικών φακέλων βρήκαμε ότι η πρωτεϊνική ζώνη στα 210kDa που αναγνωρίζουν οι οροί οφείλεται σε αντι-gp210 και επομένως η συγκεκριμένη μεθοδολογία αποτελεί ένα απλό τρόπο προσδιορισμού τους, στην PBC. Χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα καθαρές λαμίνες και ανασυνδυασμένο αμινοτελικό τμήμα του LBR, βρήκαμε ότι η συχνότητα αυτοαντισωμάτων για τις πυρηνικές λαμίνες και τον LBR είναι χαμηλή και σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες. Χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την p62 και την gp210, διαπιστώσαμε ότι δεν υπάρχουν αντι-p62 αυτοαντισώματα εκτός αν υφίστανται σε εξαιρετικά χαμηλό τίτλο, ενώ τα αντι-gp210 αντισώματα είναι τα χαρακτηριστικά περιπυρηνικά αυτοαντισώματα στη PBC (1/3 συνόλου ορών και 2/3 ορών με περιπυρηνικά αυτοαντισώματα). Εν κατακλείδι, η έρευνά μας έδειξε ότι η χρησιμοποίηση της σωστής τεχνικής απαιτεί μεταξύ άλλων γνώση των δυνατοτήτων και περιορισμών της. Δεδομένης της αναδυόμενης σημασίας των συγκεκριμένων αντισωμάτων στην διάγνωση και πρόγνωση της PBC και βασιζόμενοι στα αποτελέσματα της μελέτης μας, προτείνουμε την ανάπτυξη νέων διαγνωστικών πακέτων IIF και ELISA για τον προσδιορισμό του περιπυρηνικού φθορισμού και αντι-gp210 σε ορούς ασθενών με PBC.