Απάντηση ανθρωπίνων μονοκυττάρων σε αντιμυκητιακά φάρμακα και σε συνδυασμό αντιμυκητιακών φαρμάκων-ιντερφερόνης-γ in vitro

Abstract

Purpose: The purpose of this study was to investigate the effects of the 4 amphotericin B formulations [deoxycholate amphotericin B (DAMB) liposomal amphotericin B (LAMB), amphotericin B lipid complex (ABLC), and amphotericin B colloidal dispersion (ABCD)] on the antifungal activity of human monocytes and neutrophils against A. fumigatus and F. solani. In addition, we planned to investigate the effects of caspofungin with or without interferon-γ (IFN-γ) on the monocyte- and neutrophil- induced hyphal damage of A. fumigatus hyphae. Materials-Methods: Human monocytes and neutrophils were obtained from blood of healthy adult volunteers. Antifungal agents used were all four amphotericin B formulations in two different concentrations: DAMB (1 and 5 μg/ml), LAMB, ABLC and ABCD (5 and 25 μg/ml, for each lipid amphotericin B formulation) and the newest echinocandin, caspofungin. Strain of A. fumigatus and F. solani were used in this study. The mRNA levels and protein profiles of cytokines and chemokines expressed by human monocytes were comprehensively evaluated by semiquantitative reverse transcription-PCR and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Hyphal damage of A. fumigatus and F. solani was assessed by a modified method of XTT. Antifungal oxidative metabolism was assessed by the following methods: a) superoxide anion production (Ο2⁻) from human monocytes or neutrophils against hyphae of A. fumigatus and F. solani and b) hydrogen peroxide (H₂O₂) and secondary H₂O₂-dependent intracellular intermediates production from human monocytes against hyphae of A. fumigatus. Results: the mRNA levels of TNF-a were increased after incubation with DAMB and ABCD for 2h. ABLC was found to decrease the release of most cytokines and chemokines. DAMB and the rest of lipid amphotericin B formulations did not affect the superoxide anion production. Caspofungin increase hyphal damage induced by pretreated monocytes. Conclusions: deoxycholate amphotericin B and lipid amphotericin B formulations as well as caspofungin have certain immunomodulatory effects on human phagocytes. This means that antifungal agents have another mode of action except of the conventional antifungal action and also explain the role that they can play in the immune response of human body against invasive fungal infections.

Σκοπός: Ο σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να μελετηθεί η απάντηση των ανθρώπινων μονοκυττάρων και ουδετεροφίλων στη δράση των 4 ειδών αμφοτερικίνης Β [συμβατική δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β (DAMB), λιποσωματική αμφοτερικίνη Β (LAMB), αμφοτερικίνη Β σε μορφή λιπιδικών συμπλεγμάτων (ABLC) και αμφοτερικίνη Β σε μορφή λιπιδικού κολλοειδούς (ABCD)] έναντι υφών A. fumigatus και F. solani. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση της κασποφουγκίνης με/ή χωρίς την προσθήκη ιντερφερόνης-γ (IFN-γ) στην καταστροφή των υφών A. fumigatus από μονοκύτταρα ή ουδετερόφιλα. Υλικό-Μέθοδοι. Ως υλικό χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινα μονοκύτταρα και ουδετερόφιλα που απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα φαινομενικά υγιών ενηλίκων αιμοδοτών. Τα αντιμυκητιακά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα 4 είδη αμφοτερικίνης Β σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις: DAMB (1 και 5 μg/ml), LAMB, ABLC και ABCD (5 και 25 μg/ml, αντίστοιχα για τα λιπιδικά είδη), καθώς και ένα νεότερο αντιμυκητιακό φάρμακο της κατηγορίας των εχονοκανδινών, η κασποφουγκίνη. Τα στελέχη των μηκήτων που μελετήθηκαν ήταν ο A. fumigatus και το F. solani. Ο προσδιορισμός του αγγελιοφόρου RNA των μονοκυττάρων έγινε με τη μεθοδολογία ανάστροφης μεταγραφής-αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Ο προσδιορισμός της παραγωγής κυτταροκινών και χημειοκινών από μονοκύτταρα πραγματοποιήθηκε με την ανοσοενζυματική μέθοδο ELISA. Η καταστροφή των υφών A. fumigatus ή F. solani από μονοκύτταρα ή ουδετερόφιλα προσδιορίστηκε με την χρωματομετρική μέθοδο XTT. Ο αντιμυκητιακός οξειδωτικός μεταβολισμός προσδιορίστηκε: α) με την παραγωγή ανιόντος υπεροξειδίου (Ο2⁻) από μονοκύτταρα ή ουδετερόφιλα έναντι υφών A. fumigatus ή F. Solani, β) με την παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου (H₂O₂) και των H₂O₂-εξαρτωμένων ενδοκυττάριων παραπροϊόντων εναλλακτικών μεταβολικών οδών από μονοκύτταρα έναντι υφών A. fumigatus. Αποτελέσματα: Το mRNA του TNF-α αυξήθηκε στα μονοκύτταρα που επωάστηκαν με DAMB και ABCD για 2 ώρες. Η ABLC ελαττώνει την απελευθέρωση των περισσοτέρων κυτταροκινών και χημειοκινών. H DAMB και οι λοιπές λιπιδιακές μορφές αμφοτερικίνης Β δεν επηρέαζαν σημαντικά την παραγωγή υπεροξειδίου ανιόντος. Η κασποφουγκίνη αυξάνει τη μυκητοκτόνο δράση προεπωασμένων μονοκυττάρων. Συμπεράσματα: η δεοξυχολική και τα λιπιδιακά είδη αμφοτερικίνης Β καθώς και η κασποφουγκίνη έχουν ανοσομετατρεπτικές επιδράσεις πάνω στα φαγοκύτταρα. Το γεγονός αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία γιατί υποδεικνύει έναν άλλο τρόπο δράσης των φαρμάκων αυτών πλην της αντιμυκητιακής τους δράσης και εξηγεί τη σημασία που μπορούν να έχουν στην άμυνα του οργανισμού, κατά σοβαρών και απειλητικών για τη ζωή συστηματικών μυκητιάσεων.