Η επίδραση της φυσικής ανοσίας και νεότερων αντιμυκητιακών παραγόντων στα βιολογικά υμένια από στελέχη candida

Abstract

Introduction: Biofilm formation is an important component of catheter-related infections and generally infections related to indwelling medical devices. It is estimated that 65% of all human infections are caused by organisms growing in biofilms. Although the majority of these infections are caused by bacteria, fungal infections are becoming increasingly common; especially those caused by Candida spp., most notably Candida albicans. In children, as in adults, C. albicans ranks as the third most common cause of nosocomial bloodstream infections. In neonates, Candida parapsilosis is of particular concern given this organism’s high prevalence in catheter-related infections. Even with current antifungal therapy, mortality of patients with invasive candidiasis can be as high as 40%. Biofilms are increasingly recognized as important health problems because they are much more resistant to both antibiotics and host defence mechanisms than their planktonic counterparts. Objectives: To determine the in vitro activities of the newer antifungal agents voriconazole (VRC), posaconazole (PSC), caspofungin (CAS) and anidulafungin (ANID) against C. albicans and C. parapsilosis biofilms. Additionally, to determine the effect of human phagocytes (polymorphonuclear leukocytes, PMNs and monocytes, MNCs) alone and in combination with antifungal agents against C. albicans and C. parapsilosis biofilms. Materials-Methods: Biofilms were grown in vitro by incubation of Candida clinical isolates on the surface of silicone elastomer disks placed in 12-well or 96-well culture plates at 37°C under constant shaking for 48 h and 72 h for C. albicans and C. parapsilosis, respectively. Mature biofilms were then incubated with two-fold dilutions of VRC (0.12-256 mg/L), PSC (0.06-64 mg/L), CAS (0.01-16 mg/L) or ANID (0.007- 16 mg/L) for 24h. Percent biofilm damage was then assessed colorimetrically by XTT assay as reduction in the metabolic activity of biofilms. Biofilm MIC (BF-MIC) was defined as the least antifungal concentration causing ≥50% reduction in the metabolic activity of biofilm compared to controls. Planktonic MIC (PL-MIC) was determined according to CLSI M27-A2 microdilution method. In host defense experiments, mature biofilms were incubated with PMNs or MNCs at various dilutions. Phagocytic challenge by Candida cells was determined through the production of hydrogen peroxide (H₂O₂) and H₂O₂-dependent intracellular intermediates by means of flow cytometry. The combined effect of antifungal agents with human phagocytes was determined after incubation of PMNs or MNCs with VRC, PSC, CAS or ANID for 22 h at selected dilutions. Percent fungal damage was assessed by means of XTT assay and the morphological changes of biofilms were visualized by confocal microscopy. Cytokine release was measured by ELISA. Identical conditions were carried out with planktonic counterparts. Results: C. albicans biofilms were susceptible to echinocandins (CAS and ANID) having comparable MICs with their planktonic counterparts. C. parapsilosis biofilms had BF-MIC for echinocandins higher than PL-MIC, however BF-MIC were within the clinically achievable range of concentrations. On the contrary, biofilms were >1000 more resistant to azoles (VRC and PSC) compared with their planktonic counterparts. None of the antifungal agents tested achieved complete sterility of the silicone substrate from Candida biofilms. Biofilms appeared more resistant to phagocytes than planktonic cells. Similar phenomenon was not observed for resuspended biofilm cells. Resuspended biofilm cells and planktonic cells induced the same fungal damage and oxidative burst by human phagocytes. Confocal microscopy demonstrated absence of phagocytosis within biofilms. Preincubation of phagocytes with cytokines (IFN-γ or G-CSF) did not augment phagocytic effect against biofilms. Besides, biofilms were more resistant to the combined effect of phagocytes and antifungal agents as compared with their planktonic counterparts. An additive effect occurred between phagocytes and ANID against C. albicans and C. parapsilosis biofilms. ANID elicited an increased TNF-a and a reduced IL-8 release from MNCs incubated with C. albicans biofilms. The immunopharmocological effects of antifungal agents against biofilms correlated with changes in biofilm morphology, as depicted by confocal microscopy. Conclusions: Echinocandins are more effective than azoles against Candida spp. biofilms. Biofilm resistance to host defenses could be attributed to lack of phagocytosis. The additive interaction of ANID with phagocytes against Candida biofilms results in a beneficial Th1 response. This finding could open up new avenues for the management of infections related to Candida biofilms. Together our observations suggest that the major contributor for this recalcitrant behaviour of Candida biofilms could be the biofilm ultrastructure.

Εισαγωγή: Βασικός λοιμογόνος παράγοντας των λοιμώξεων, που σχετίζονται με τη χρήση καθετήρων και γενικότερα βιοπροσθετικών υλικών, αποτελούν τα βιολογικά υμένια (ΒΥ). Γενικά εκτιμάται ότι το 65% όλων των λοιμώξεων σχετίζονται με το σχηματισμό ΒΥ. Παρόλο που η πλειοψηφία των λοιμώξεων, που σχετίζονται με τα ΒΥ, προέρχονται από βακτήρια, οι αντίστοιχες λοιμώξεις από μύκητες εμφανίζονται όλο και συχνότερα, ιδιαίτερα αυτές από είδη του γένους Candida και ιδιαίτερα Candida albicans. Στα παιδιά, όπως και στους ενήλικες, η C. αlbicans αποτελεί την 3η σε σειρά συχνότητας αιτία πρόκλησης νοσοκομειακών μικροβιαιμιών. Στα νεογνά, η Candida parapsilosis εμφανίζει αυξημένο επιπολασμό στις λοιμώξεις, που σχετίζονται με τους καθετήρες. Ακόμα και με τα νεότερα αντιμυκητιακά φάρμακα, η θνητότητα στους ασθενείς με διεισδυτικές μορφές καντιντίασης μπορεί να φτάσει το 40%. Τα ΒΥ αναδεικνύονται πλέον σε μείζον πρόβλημα στην ιατρική λόγω της αυξημένης αντοχής τους τόσο στους διάφορους αντιμικροβιακούς παράγοντες όσο και στην άμυνα του ξενιστή. Σκοπός: Να εξεταστεί in vitro η δράση νεότερων αντιμυκητιακών παραγόντων, της βορικοναζόλης (VRC), της ποσακοναζόλης (PSC), της κασποφουγκίνης (CAS) και της ανιδουλαφουγκίνης (ΑΝΙD) έναντι των ΒΥ από C. albicans και C. parapsilosis. Επίσης να διερευνηθεί η δράση των ανθρώπινων φαγοκυττάρων (πολυμορφοπυρήνων, PMNs και μονοκυττάρων, MNCs) καθώς και η συνδυασμένη επίδραση των αντιμυκητιακών παραγόντων με τα φαγοκύτταρα έναντι των ΒΥ από C. albicans και C. parapsilosis. Υλικό-Μέθοδος: ΒΥ αναπτύχθηκαν in vitro στην επιφάνεια δισκίων σιλικόνης μέσα σε πλάκες κυτταροκαλλιεργειών 12 ή 96 βοθρίων στους 37°C για 48 και 72 ώρες για την C. albicans και C. parapsilosis, αντίστοιχα. Στη συνέχεια τα ώριμα ΒΥ επωάστηκαν με διαδοχικές συγκεντρώσεις VRC (0.12-256 mg/L), PSC (0.06-64 mg/L), CAS (0.01-16 mg/L) και ANID (0.007-16 mg/L) για 24 ώρες. Η επίδραση των αντιμυκητιακών φαρμάκων στα ΒΥ εκτιμήθηκε με τη χρωματομετρική μέθοδο ΧΤΤ ως % καταστροφής των μυκήτων. Ως ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις των φαρμάκων για τα ΒΥ (BF-MIC) ορίστηκαν οι ελάχιστες συγκεντρώσεις αυτών, που προκαλούν ≥50% ελάττωση στη μεταβολική δραστηριότητα των ΒΥ σε σχέση με τα ΒΥ-μάρτυρες. Οι ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις των φαρμάκων (PL-MIC) για τις ελεύθερες μορφές των μυκήτων προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο CLSI (NCCLS) M27A2. Στα πειράματα προσδιορισμού της επίδρασης των φαγοκυττάρων, ώριμα ΒΥ επωάστηκαν με PMNs ή MNCs σε διάφορες αραιώσεις. Η επίδραση των φαγοκυττάρων εκτιμήθηκε και μέσω της παραγωγής H₂O₂ και των H₂O₂-εξαρτωμένων ενδοκυττάριων παραπροϊόντων εναλλακτικών μεταβολικών από τα PMNs με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής. Η συνδυασμένη επίδραση των αντιμυκητιακών φαρμάκων με τα φαγοκύτταρα εκτιμήθηκε μετά από επώαση για 22 ώρες PMNs ή MNCs και VRC, PSC, CAS ή ANID σε επιλεγμένες αραιώσεις. Εκτιμήθηκε η % καταστροφή των μυκήτων με τη μέθοδο ΧΤΤ καθώς και οι μορφολογικές αλλοιώσεις των ΒΥ με το συνεστιακό μικροσκόπιο. Επίσης εκτιμήθηκε η απελευθέρωση κυτταροκινών με ELISA. Οι συνθήκες που εξετάστηκαν στα ΒΥ ελέγχθηκαν παράλληλα με πλανκτονικά κύτταρα Candida. Αποτελέσματα: Τα ΒΥ από C. albicans ήταν ευαίσθητα στη δράση των εχινοκανδινών (CAS και ANID) έχοντας συγκρίσιμες ΜΙC με τις πλανκτονικές μορφές των μυκήτων. Για την C. parapsilosis, οι BF-MIC των εχινοκανδινών, αν και υψηλότερες από τις αντίστοιχες PL-MIC, παρέμειναν σε κλινικά αποδεκτές συγκεντρώσεις. Αντίθετα, τα ΒΥ ήταν >1000 φορές πιο ανθεκτικά στη δράση των αζολών (VRC, PSC) σε σύγκριση με τις πλανκτονικές μορφές. Κανένα από τα αντιμυκητιακά φάρμακα που ελέγχθηκαν δε φάνηκε να επιτυγχάνει πλήρη αποστείρωση του υποστρώματος της σιλικόνης από τα ΒΥ της Candida. Τα ΒΥ φάνηκαν πιο ανθεκτικά στη δράση των φαγοκυττάρων σε σχέση με τα πλανκτονικά κύτταρα. Αντίθετα δεν παρατηρήθηκε το ίδιο και με τα κύτταρα από «διαλυμένα» ΒΥ, που εμφάνιζαν το ίδιο ποσοστό καταστροφής και προκάλεσαν στον ίδιο βαθμό την οξειδωτική έκρηξη από τα φαγοκύτταρα σε σχέση με τα πλανκτονικά κύτταρα. Από τη μελέτη της αλληλεπίδρασης των φαγοκυττάρων με τα ΒΥ με το συνεστιακό μικροσκόπιο φάνηκε ότι τα μονοκύτταρα δεν παρουσίαζαν φαγοκυτταρική δραστηριότητα. Η προεπώαση των φαγοκυττάρων με κυτταροκίνες (IFN-γ ή G-CSF) δε φάνηκε να ενισχύει την καταστροφή των ΒΥ. Επίσης τα ΒΥ ήταν πιο ανθεκτικά και στη συνδυασμένη επίδραση των φαγοκυττάρων με τα αντιμυκητιακά φάρμακα σε σχέση με τα πλανκτονικά. Αθροιστική αλληλεπίδραση διαπιστώθηκε μεταξύ φαγοκυττάρων και ANID έναντι των ΒΥ της C. albicans και C. parapsilosis. Η αθροιστική αυτή αλληλεπίδραση συνοδεύτηκε από αύξηση του TNF-α και ελάττωση της IL-8 κατά την επώαση MNCs με ΒΥ της C. albicans. Οι ανοσοφαρμακολογικές επιδράσεις των αντιμυκητιακών φαρμάκων έναντι των ΒΥ συνοδεύτηκαν και από αντίστοιχες αλλαγές στη δομή των ΒΥ, όπως φάνηκε στο συνεστιακό μικροσκόπιο. Συμπεράσματα: Οι εχινοκανδίνες υπερέχουν των αζολών στην καταστροφή των ΒΥ από C. albicans και C. parapsilosis.. Τα ΒΥ είναι ανθεκτικά στη δράση των φαγοκυττάρων γεγονός που θα μπορούσε να οφείλεται στην αδυναμία φαγοκυττάρωσης. Η ANID, εμφανίζοντας αθροιστική αλληλεπίδραση με τα φαγοκύτταρα, επάγει μια τύπου Th1 ανοσιακή απάντηση έναντι των ΒΥ, εύρημα που θα μπορούσε να αποτελέσει το έναυσμα για τη διάνοιξη νέων θεραπευτικών εναλλακτικών έναντι των ΒΥ της Candida. Η ίδια η δομή του ΒΥ, με την εξωκυττάρια ουσία που περιβάλλει το δίκτυο των υφών, θα μπορούσε να αποτελεί αιτιολογικό παράγοντα για την αυξημένη αντοχή των ΒΥ της Candida στα αντιμυκητιακά φάρμακα και στα κύτταρα του συστήματος της φυσικής ανοσίας.