Μελέτη της αγγειογένεσης στην αληθή πολυκυτταραιμία

Abstract

The role of angiogenesis is critical for tumor and haematopoietic malignancies progression and is under investigation for myeloproliferative diseases. Increased angiogenic activity has been demonstrated in myelofibrosis with myeloid metaplasia, chronic myeloid leukemia, and essential thrombocythemia. Few are reported on angiogenesis in Polycythaemia Vera (PV) and the significance of angiogenic stimulators as Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), basic Fibroblast Growth Factor (b FGF) Angiogenin (Ang), Metalloproteinase-9 and the microvessel density (MVD) in trephine biopsies of polycythaemic patients. Therefore, we report our observations in patients with PV concerning the serum levels of VEGF and b FGF, Αngiogenin and Metalloproteinase-9, as well as the microvessel density in bone marrow samples immunostained with anti- CD₃₄ monoclonal antibody. A total of 38 patients with PV (22 males and 16 females) with a mean age of 56,1±2,5 (m ± SΕΜ) years (range 21-81) were included. Τwenty two patients were managed with phlebotomy, four received hydroxyurea, eight were managed with hydroxyurea and phlebotomy and one was treated with interferon and three patients did not get any treatment. Three had clinically detected spleen enlargement and fiver had experienced a thrombotic complication. The control group consisted of 22 healthy subjects (mean age 55,3 ± 1,3 years). The age difference between the two groups was not statistically significant (p=0,82). Serum levels of VEGF, bFGF, Ang and ΜΜP-9 were measured by commercial quantitatives sandwich enzyme immunoassays. In twenty four of them we estimated the MVD in bone marrow samples immunostained with anti-CD₃₄ monoclonal antibody by counting the number of vessels per 400x high power field (HPF) using light microscopy. Serum VEGF levels in PV were found to be significantly higher than in healthy individuals (510,6 ± 87,8 vs 182,7 ± 27,2, pg/ml respectively, p=0,032). We found no correlation between VEGF and haemoglobin, platelet or leukocyte counts in the patient group. Different therapeutic regimens had no influence on VEGF levels. However, in the control group, we observed a positive correlation between VEGF levels and platelet counts (r=0,48, p=0,038). Platelet counts did not differ between patients and healthy subjects. We also evaluated b FGF levels in the two groups. We found no differences in serum b FGF concentrations between patients and controls. In the patient group we found no correlation between b FGF levels and platelet count, Hb, WBC count, age and therapeutic regimen. On the contrary we found a very interesting positive correlation between b FGF and VEGF levels only in the group of PV patients (r=0,42, p=0,009). Serum Angiogenin levels were found to be significantly higher than in healthy individuals 432,2 ± 24 pg/ml and 366,1 ± 31,4 pg/ml respectively, (p=0,036). Interestingly a negative correlation was found between serum Angiogenin levels and the microvessel density of the bone marrow. We also found that patients with a thrombotic complication had lower angiogenin levels in comparison to patients without such a complication (279,6 ± 4,7 vs 457,7 ± 36,5, p=0,019). We found no differences in serum Metalloproteinase-9 concentrations between patients and controls and we found a positive correlation between VEGF levels and MMP-9 levels (r=0,36, p=0,03) in patients group. The microvessel density was found significantly higher (4,2 ± 0,4 vessels per HPF) in comparison to control groups that were consisted by 10 normal individuals (1,6 ± 0,2 vessels per HPF) and 12 patients with other myeloproliferative disorder (9,0 ± 1,5 vessels per HPF). We divided the group of patients in two subgroups according to the grade of fibrosis (grade 0-1 and grade 1-2) of their bone marrows. In the first subgroup we found 3,4 ± 0,9 vessels per HPF while in the second subgroup we found 5,3 ± 2,1 vessels per HPF. The difference among the two groups is statistically significant (p=0,005) and we found a positive correlation between MVD and reticulin fibrosis grade in patients with PV (r=0,59, p=0,0025). We also measured the angiogenetic factors that are implicated in fibroblast proliferation, bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) and VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), in the sera of the two groups of PV patents. We found no statistically significant difference among the two subgroups (p= 0,42 and p=0,84) respectively. Our study showed an increased angiogenic activity in patients with polycythaemia vera independently of the therapeutic approach. The exact contribution of the angiogenic factors that we have measured in the pathophysiology of PV and their prognostic significance as disease activity markers deserve further research.

Ο ρόλος της αγγειογένεσης είναι κριτικός για την αύξηση των όγκων και την εξέλιξη ποικίλων αιματολογικών κακοηθειών ενώ αποτελεί αντικείμενο μελέτης αναφορικά με τα μυελοϋπερπλαστικά σύνδρομα. Αυξημένη αγγειογενετική διαδικασία έχει βρεθεί στην ιδιοπαθή μυελοΐνωση, στη χρονία μυελογενή λευχαιμία και στην ιδιοπαθή θρομβοκυττάρωση. Περιορισμένες είναι οι μελέτες και αποσπασματικές της αγγειογένεσης στην αληθή πολυκυτταραιμία είτε με τον προσδιορισμό της μικροαγγειακής πυκνότητας είτε μέσω των προσδιορισμών αγγειογενετικών παραγόντων. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή έγινε προσπάθεια προσέγγισης της αγγειογένεσης με δύο τρόπους άμεσα και έμμεσα. Η πρώτη προσέγγιση ήταν με τη μελέτη της μικροαγγειακής πυκνότητας των οστεομυελικών βιοψιών των ασθενών χρησιμοποιώντας το αντί-CD₃₄ αντίσωμα που χρώνει κυρίως ενδοθηλιακά κύτταρα και υπερτερεί των άλλων μεθόδων. Η άλλη προσέγγιση αφορά την εκτίμηση της αγγειογένεσης έμμεσα μέσω του προσδιορισμού συγκεκριμένων αγγειογενετικών παραγόντων (VEGF, bFGF, αγγειογενίνης και μεταλλοπρωτεϊνάσης 9) στον ορό των ασθενών με αληθή πολυκυτταραιμία. Στην εργασία αυτή συνολικά μελετήθηκαν 60 άτομα: 38 ασθενείς διάρκειας νόσου από 0 έως 20 έτη, εκ των οποίων παρουσίαζαν σπληνομεγαλία οι 3 ασθενείς και θρομβωτικό επεισόδιο οι 5 ασθενείς, και 22 υγιείς που απετέλεσαν την ομάδα ελέγχου. Η μέση ηλικία δεν διέφερε στις δύο ομάδες (p=0,82). Σε όλα τα άτομα έγινε προσδιορισμός των αγγειογενετικών παραγόντων VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF (basic Fibroblast Growth Factor), Aγγειογενίνης (Αng) και της Μεταλλοπρωτεϊνάσης 9 (ΜΜΡ-9) με ανοσοενζυμικές μεθόδους Elisa. Ο προσδιορισμός της μικροαγγειακής πυκνότητας σε τομές οστεομυελικής βιοψίας έγινε μετά από ανοσοϊστοχημική χρώση με αντί-CD₃₄ μονοκλωνικό αντίσωμα. Ο προσδιορισμός της μικροαγγειακής πυκνότητας πραγματοποιήθηκε σε 24 από τους ασθενείς με αληθή πολυκυτταραιμία κατόπιν συναίνεσής τους. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αυτά που βρέθηκαν από τη μικροαγγειακή πυκνότητα των οστεομυελικών βιοψιών 10 ατόμων χωρίς αιματολογική κακοήθεια και 12 ασθενών με άλλο μυελοϋπερπλαστικό σύνδρομο (8 ασθενείς πάσχοντες από ιδιοπαθή θρομβοκυττάρωση και 4 ασθενείς πάσχοντες από ιδιοπαθή μυελοΐνωση) που χρησιμοποιήθηκαν συγκριτικά ως παθολογικοί μάρτυρες. Οι ασθενείς της μελέτης παρουσίαζαν αυξημένη μικροαγγειακή πυκνότητα σε σχέση με τους υγιείς (4,2 ± 0,4 προς 1,6 ± 0,2, p=0,0002), αυξημένα επίπεδα VEGF(510,6 ± 87,8 προς 182,7 ± 27,2, p=0,032) και αγγειογενίνης (432,2 ± 24 προς 366,1 ± 31,4 p=0,036) ενώ τα επίπεδα των bFGF και της ΜΜΡ-9 δεν διέφεραν σε σχέση με τους υγιείς. Στην ομάδα των ασθενών ο VEGF δεν συσχετίζονται με την ηλικία, τα αιμοπετάλια, την αιμοσφαιρίνη και τον αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων. Στην ομάδα των φυσιολογικών μαρτύρων ο παράγοντας VEGF παρουσίαζε θετική συσχέτιση με τα αιμοπετάλια (r=0,46, p=0,038). O παράγοντας bFGF στην ομάδα των ασθενών και στην ομάδα των φυσιολογικών μαρτύρων δεν συσχετίζεται με την ηλικία, τα αιμοπετάλια, την αιμοσφαιρίνη και τον αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων. Τα επίπεδα της αγγειογενίνης στην ομάδα των ασθενών και στην ομάδα των φυσιολογικών μαρτύρων δεν συσχετίζονται με την ηλικία, τα αιμοπετάλια, την αιμοσφαιρίνη και τον αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων. Τα επίπεδα της μεταλλοπρωτεϊνάσης 9 στην ομάδα των ασθενών και στους υγιείς δεν συσχετίζονται με την ηλικία, τα αιμοπετάλια, την αιμοσφαιρίνη και τον αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων. Από τη στατιστική επεξεργασία των ευρημάτων βρέθηκε ότι ο VEGF συσχετίζεται με τον bFGF (p=0,008 και r=0,42) και την μεταλλοπρωτεϊνάση 9 (p=0,03 και r=0,36) ενώ, δε βρέθηκε συσχέτισή του με την αγγειογενίνη (p=0,70 και r=-0,01). Τέλος η αγγειογενίνη παρουσιάζει αρνητική συσχέτιση με την μικροαγγειακή πυκνότητα (p=0,03 και r=-0,47). Στην αληθή πολυκυτταραιμία παρατηρήθηκε αυξημένη αγγειογενετική διαδικασία όπως εκφράστηκε αυτή μέσω της αυξημένης μικροαγγειακής πυκνότητας και των αυξημένων επιπέδων του VEGF αλλά και της αγγειογενίνης. Πρέπει να σημειωθεί ότι το είδος της θεραπείας που ήταν αφαιμάξεις, υδροξυουρία, καθώς και ο συνδυασμός των δύο δεν επηρέαζε την έκφραση των δεικτών της αγγειογένεσης. Οι αγγειογενετικοί παράγοντες αλλά και η μικροαγγειακή πυκνότητα δεν φάνηκε να επηρεάζονται από τη διάρκεια νόσου των ασθενών. Επιπλέον αναλύοντας τα κλινικά δεδομένα βρήκαμε ότι οι ασθενείς που είχαν παρουσιάσει θρομβωτικό επεισόδιο (5 άτομα) είχαν χαμηλότερα στατιστικά σημαντικά επίπεδα αγγειογενίνης σε σύγκριση με τους ασθενείς που δεν είχαν υποστεί θρομβωτικό επεισόδιο. Μελετώντας το βαθμό της αγγειογένεσης σε σχέση με τον βαθμό της ίνωσης στους ασθενείς μας, παρατηρήσαμε ότι οι ασθενείς με αυξημένο βαθμό ίνωσης παρουσίαζαν και αυξημένη μικροαγγειακή πυκνότητα και επιπλέον παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση ανάμεσα στην ίνωση του μυελού και την μικροαγγειακή πυκνότητα. Συμπερασματικά θεωρούμε ότι παρατηρείται αυξημένη αγγειογενετική διαδικασία στην αληθή πολυκυτταραιμία όπως εκφράστηκε αυτή μέσω της αυξημένης μικροαγγειακής πυκνότητας και των αυξημένων επιπέδων του VEGF αλλά και της αγγειογενίνης καθώς και των στατιστικών συσχετίσεων των επιπέδων του VEGF με τους bFGF και την μεταλλοπρωτεϊνάση 9. Η αυξημένη αγγειογένεση ίσως αποτελεί την παράλληλη εκδήλωση της μυελικής υπερπλασίας που παρατηρείται στη νόσο. Η διαλεύκανση της μοριακής παθογένειας πιθανά να δώσει απαντήσεις για την αιτιολογία της αγγειογένεσης στην αληθή πολυκυτταραιμία, ενώ στο μέλλον πιθανά η αντιαγγειογενετική θεραπεία να έχει θέση και στην θεραπευτική αντιμετώπιση της νόσου αυτής.