Μελέτη του οστικού μεταβολισμού στην κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων

Abstract

Bone as a regulator of human hematopoietic stem cell (HSC) trafficking: Study of biochemical markers of bone remodeling and angiogenic cytokines during HSC mobilization, in patients candicates to autologous hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT).Background: The mobilization and collection of peripheral blood stem cells (PBSC) is a standard procedure in the treatment of many hematologic malignancies, both in the autologous and allogeneic stem cell transplantation setting. The proposed mechanisms of HSC mobilization, based on animal models, implicate the G-CSF-mediated proteolytic cleavage of important ligands, such as stromal-derived factor-1 (SDF-1) and the suppression of these ligands on marrow stroma, and especially on osteoblasts (OB). These events abolish the HSC-niche adhesion and lead to HSC mobilization. Today, bone cells are not considered just as a structural, non-functional, supportive tissue for bone marrow, but as HSC-niche regulators. However, there are scarce data regarding the role of bone turnover in HSC mobilization in humans.Aim: To study biochemical markers of bone remodeling and angiogenic cytokines in the process of HSC mobilization of patients with lymphoma and multiple myeloma.Methods: Forty-six patients (18 with Non-Hodgkin lymphoma and 14 with multiple myeloma and Hodgkin lymphoma, respectively) were studied. Serum samples from each patient were collected at two different time points: before the initiation of mobilization (pre-mobilization sample) and on the day of PBSCcollection, which coincided with the highest circulating CD34 counts (collection sample). Moreover, 3 additional serum samples from 19/46 patients were collected, between mobilization and collection. The following molecules were measured by ELISA in patients’ sera: 1) bone resorption markers, carboxyterminal telopeptide of collagen type 1 (CTX), aminoterminal telopeptide of collagen type 1 (NTX) and tartrate resistant acid phosphatase isoform 5b (TRACP-5b), 2) bone formation markers, bone alkaline phosphatase (BALP), osteocalcin (OSC) and osteopontin (OPN), 3) the marker of osteocyte activity dickkopf-1 (DKK-1), an important inhibitor of Wnt-signalling and osteoblastogenesis 4) the osteoclastic regulators receptor activator NF-kB ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG), 5) angiogenic cytokines angiopoietin-1 (ANGP1), angiopoietin-2 (ANGP2) and angiogenin (ANG), 6) cytokine IL-11, adhesion molecule intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), chemokine SDF-1 and proteinoglycan Syndecan-1.Values between the two different time points were compared with nonparametric methods. Patients who had either a PBSC (CD34+cells) collection <2.0x106/kg, or a circulating CD34 count peak <20/μL were considered as “poor mobilizers”.Results: The comparison of the molecules under study between the premobilization and collection samples revealed the following: BALP (p=0.000) and OPN (p=0.049) increased significantly between pre-mobilization and collection. OSC, a marker of bone turnover, as well as DKK-1 decreased significantly (p=0.000 and p=0.041, respectively). These findings, all together reveal significant increase of bone formation during HSC mobilization. At the same time, there was a significant increase of RANKL (p=0.000) and OPG (p=0.000) levels, leading to an increase of RANKL/OPG ratio (p=0.000), showing osteoclastogenesis enchacement and osteoclastic activation. This finding was however most prominent in patients with myeloma. Interestingly, there was no evidence of increased osteoclastic activity, as CTX decreased significantly (p=0.026), while both NTX and TRACP-5b did not change. ANGP-1 showed a dramatic reduction (p=0.000), while ANGP-2 increased (p=0.000), resulting in a significant decrease of the ANGP-1/ANGP-2 ratio, a finding indicating significant vessel destabilization during mobilization. The aforementioned results were further supported by the intermediate measurements, which showed a straightforward alteration of bone metabolism early in HSC mobilization. The comparison between good and poor mobilizers revealed that poor mobilizers had significantly higher CTX levels both at pre-mobilization (p=0.004) and collection samples (p=0.001), higher NTX levels at collection (p=0.02), lower ANGP-1 pre-mobilization (p=0.004) and higher OSC at collection (p=0.000) compared to good mobilizers. It seems that CTX, NTX and ANGP-1 premobilization levels may serve as reliable predictors of poor mobilization.Summary/Conclusions: Our study showed for the first time that bone plays adynamic role during human HSC mobilization: Bone formation and vessel destabilization are the two major events and osteoblasts seem to be the major orchestrating cells during this process. Osteoclasts are stimulated, but not fully active. Moreover, several of these markers may identify poor mobilizers.

Ο οστίτης ιστός ως ρυθμιστής της ανθρώπινης κινητοποίησης των αρχέγονων αιμοποιητικών αιμοποιητικών κυττάρων (hematopoietic stem cells-HSC): Δείκτες οστικού μεταβολισμού και αγγειογενετικές κυττοκίνες στην HSC κινητοποίηση ασθενών, υποβαλλόμενων σε αυτόλογη μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (ΑΜΑΑΚ).Εισαγωγή: Η κινητοποίηση και συλλογή των HSC του αίματος θεωρείται βασική θεραπευτική στρατηγική σε αρκετές αιματολογικές κακοήθειες που χρήζουν ΑΜΑΑΚ. Οι προτεινόμενοι μηχανισμοί κινητοποίησης των HSC, από τη νησίδα του μυελού των οστών που κατοικούν στην κυκλοφορία, στηρίζονται σε μελέτες σε πειραματόζωα και εμπλέκουν την G-CSF-επαγόμενη πρωτεόλυση κρίσιμων συνδετών, όπως ο παράγοντας-1 προερχόμενος από κύτταρα του στρώματος (SDF-1), και τη μείωση έκφρασης των συνδετών αυτών από το μυελικό στρώμα και ειδικά τους οστεοβλάστες (ΟΒ). Τα γεγονότα αυτά αίρουν την προσκόλληση των HSC στη νησίδα και τα οδηγούν σε κινητοποίηση. Πλέον ο οστίτης ιστός δεν θεωρείται απλά ένας δομικός, μη λειτουργικός, στηρικτικός ιστός του μυελού των οστών αλλά ρυθμιστής της HSC νησίδας, πλην όμως, υπάρχουν ελάχιστες πληροφορίες αναφορικά με το ρόλο της οστικής ανακατασκευής στην ανθρώπινη HSC κινητοποίηση.Σκοπός: Η μελέτη δεικτών του οστικού μεταβολισμού και αγγειογενετικών κυττοκινών στην HSC κινητοποίηση ασθενών με λέμφωμα ή πολλαπλό μυέλωμα.Μέθοδοι: Μελετήθηκαν 46 ασθενείς (18 με Non-Hodgkin λέμφωμα και 14 με πολλαπλό μυέλωμα και Hodgkin λέμφωμα αντίστοιχα). Συλλέχθηκε ορός από κάθε ασθενή σε δύο κομβικές χρονικές στιγμές: προ της έναρξης της κινητοποίησης και την ημέρα της συλλογής των HSC. Επιπλέον συλλέχθηκαν και 3 ενδιάμεσα, αλληλοδιάδοχα δείγματα ορού κατά τη διάρκεια της κινητοποίησης. Μετρήθηκαν με ELISA τα ακόλουθα μόρια στον ορό τωνασθενών: 1) Δείκτες οστικής απορρόφησης: CTX και NTX (τελοπεπτίδια-προιόντα απορρόφησης κολλαγόνου τύπου Ι μέσω καθεψίνης Κ των οστεοκλαστών) και TRACP-5b (ισομορφή 5b της όξινης φωσφατάσης ανθεκτικής στο τρυγικό οξύ, ένζυμο των οστεοκλαστών που αποδομεί την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία), 2) Δείκτες οστικής δόμησης / ανακατασκευής: οστική αλκαλική φωσφατάση (BALP), οστεοκαλσίνη (OSC) και οστεοποντίνη (OPN), 3) Δείκτης δραστηριότητας οστεοκυττάρων και αναστολέας οστεοβλαστογένεσης / οστικής δόμησης: dickkopf-1 (DKK-1), 4) Δείκτες δραστηριότητας οστεοκυττάρων και OB και ρυθμιστές οστεοκλαστών: συνδέτης του υποδοχέα-ενεργοποιητή πυρηνικού παράγοντα κ-ελαφράς αλυσίδας, ευοδωτή ενεργοποιημένων Β-κυττάρων (RANKL) και οστεοπροτεγερίνη (OPG), 5) Δείκτες αγγειογένεσης: αγγειογενίνη (ANG), αγγειοποιητίνη-1 και -2 (ANGP-1 και ANGP-2), 6) Η κυττοκίνη ιντερλευκίνη-11 (IL-11), το διακυτταρικό κυτταρικό μόριο προσκόλλησης 1 (ICAM-1), η χημοκίνη SDF-1 και η πρωτεϊνογλυκάνη syndecan-1 (SYND-1). Οι τιμές των δειγμάτων συγκρίθηκαν με μη παραμετρικές μεθόδους. Ασθενείς στους οποίους συλλέχθηκαν CD34+ κύτταρα <2,0x106/kg ή/και η μέγιστη τιμή των κυκλοφορούντων CD34+ κυττάρων ήταν <20/μL θεωρήθηκαν «πτωχοί κινητοποιητές».Αποτελέσματα: Η σύγκριση των μορίων μεταξύ των δύο χρονικών στιγμών (δείγμα προ κινητοποίησης και δείγμα συλλογής) ανέδειξε τα παρακάτω: Η BALP (p=0.000) και η OPN (p=0.049) αυξάνονται στατιστικά σημαντικά μεταξύ προ κινητοποίησης και συλλογής. Η OSC, δείκτης οστικής ανακατασκευής, μειώνεται (p=0.000), όπως και ο DKK-1 (p=0.041), ο οποίος ως κρίσιμος μεταγραφικός συν-παράγοντας για την έκφραση της OSC στους ώριμους ΟΒ,ίσως εξηγεί την πτώση της. Τα δεδομένα αυτά καταδεικνύουν σημαντική αύξηση της οστικής δόμησης κατά την κινητοποίηση. Ο RANKL (p=0.000) και η OPG (p=0.000) αυξάνονται σημαντικά, οδηγώντας περαιτέρω σε σημαντική αύξηση του λόγου RANKL/OPG (p=0.000), αναδεικνύοντας ευόδωση οστεοκλαστογένεσης και ενεργοποίησης οστεοκλαστών κατά την κινητοποίηση, εύρημα κυρίως στους ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα. Πλην όμως αύξησηοστεοκλαστικής δραστηριότητας και οστικής απορρόφησης δεν απεδείχθη εφόσον το CTX μειώθηκε (p=0.026) ενώ το NTX και η TRACP-5b δεν μεταβλήθηκαν. Η ANGP-1 μειώθηκε δραματικά (p=0.000) ενώ η ANGP-2 αυξήθηκε (p=0.000), οδηγώντας σε σημαντική πτώση του λόγου ANGP-1/ANGP-2 (p=0.000), γεγονός που υποδηλώνει έντονη αγγειακή αποσταθεροποίηση κατά την HSC κινητοποίηση. Οι μετρήσεις των ενδιάμεσων ευρημάτων ανέδειξαν ενεργοποίηση του οστικού μεταβολισμού 2-4 ημέρες από την έναρξη της κινητοποίησης και κατοχύρωσαν τα προαναφερόμενα αποτελέσματα. Η σύγκριση μεταξύ καλών και πτωχών κινητοποιητών κατέδειξε, μεταξύ των άλλων, ότι οι πτωχοί κινητοποιητές είχαν στατιστικώς σημαντικά υψηλότερα επίπεδα CTX τόσο στο δείγμα προ κινητοποίησης (p=0.004) όσο και στο δείγμα συλλογής (p=0.001), υψηλότερα επίπεδα NTX στη συλλογή (p=0.02), χαμηλότερα επίπεδα ANGP-1 προ κινητοποίησης (p=0.004) και υψηλότερα επίπεδα OC στη συλλογή (p=0.000) σε σύγκριση με τους καλούς κινητοποιητές. Τα επίπεδα CTX, NTX και ANGP-1 προ κινητοποίησης φαίνεται να διακρίνουν στατιστικά την πτωχή κινητοποίηση.Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν για πρώτη φορά ότι η αύξηση της οστεοβλαστικής δραστηριότητας/οστικής δόμησης και η αγγειακή αποσταθεροποίηση αποτελούν σημαντικά γεγονότα στην ανθρώπινη HSC κινητοποίηση, καταδεικνύοντας το δυναμικό ρόλο του οστίτη ιστού. Ενώ η ενεργοποίηση των οστεοκλαστών συμβαίνει στην HSC κινητοποίηση, δεν συνοδεύεται από αύξηση οστικής απορρόφησης. Επιπλέον, κάποιοι από τους δείκτες οστικού μεταβολισμού και αγγειογένεσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην αναγνώριση των πτωχών κινητοποιητών.