Ογκογονιδιακός έλεγχος σε αιματολογικές νόσους. Ο ρόλος του ογκοκατασταλτικού γονιδίου IRF-1 (interferon regulatory factor-1) στη χρόνια μυελογενή λευχαιμία και στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα

Abstract

Interferons are cytokines that have been shown in vitro and in vivo to possess antiviral, antitumor and immunoregulatory properties. Interferons transcriptionally activate target genes through the JAK–STAT and Interferon Regulated Factors (IRFs) family pathways. Interferon Regulated Factor-1 (IRF-1) is a trancriptional activator of genes critical for cell growth, differentiation and apoptosis. Findings, showing skipping of exons 2 or 2 and 3 of IRF-1 in patients with Myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myelogenous leukaemia (AML), suggest that this factor may have a critical role in leukaemiogenesis. Furthermore, IRF-1 plays a crucial role in the regulation of antigen presentation and TH1 differentiation. Thus, IRF-1 is a transcription factor linking the immune response and oncogenesis. The aim of this study was to elucidate if genetic alterations of IRF-1 play role in both pathogenesis of CML and interferon treatment responsiveness, as well as to investigate the possible role of IRF-1 in the development of autoimmune manifestations (AIMs) in patients with (MDS). Therefore, mutational analysis of IRF-1 was performed and its expression pattern was also studied in PBMCs of 21 patients in chronic phase CML and 14 patients with MDS (7 with and 7 without AIMs). In order to have more reliable results we also studied 10 normal individuals and 4 patients with hairy cell leukaemia (HCL) undergoing treatment with interferon-α. To detect mutations in the IRF-1 mRNA we used the Non Isotopic RNA Cleavage Assay (NIRCA) and direct sequencing, while Quantitative analysis of IRF-1 mRNA expression was performed using the QuantumRNA classic II 18S Kit. This is a semi-quantitative method that uses 18S rRNA as internal control. No point mutations were identi?ed at the cDNA level in CML patients. Surprisingly, four-fold reduction of full length IRF-1 mRNA expression was established in 17/21 patients compared with normal individuals. Low expression of full length IRF-1 was observed in conjunction with high levels of aberrantly spliced mRNAs consisting of skipping of exons 2 or 2 and 3 combined with skipping of exons 6,7,8 and 9 in various combinations. In two patients, skipping of exon 5 was the main transcript, while skipping of exon 3 was also found. In 3 patients that were also analysed during blastic transformation, further reduction of full length IRF-1 mRNA was observed. According to MDS patients, very low or absent of IRF-1 mRNA transcripts were observed in patients without AIMs compared to normal individuals. In contrast, MDS patients with AIMs overexpressed IRF-1 transcripts compared with MDS patients without AIMs, in a level almost equal to that observed in normal individuals. Additionally, low expression of full-length IRF-1 mRNA in MDS patients without AIMs was observed in conjunction with aberrantly spliced mRNAs. In conclusion, these ?ndings demonstrate that, in CML patients, IRF-1 can produce high levels of aberrant spliced mRNAs with subsequent reduction in the levels of full length IRF-1 mRNA. This observation is consistent with the notion that exon skipping constitutes an important mechanism of tumor suppressor gene inactivation in this disease. In addition, overexpression of IRF-1 in MDS patients was coupled with immune deregulation and AIMs, indicating the possible role of IRF-1 in the pathogenesis of autoimmunity in MDS, as a result of TH1 immune response.

Οι ιντερφερόνες είναι κυτταροκίνες που έχουν αντιιική, αντιπρωτοζωική, ανοσορρυθμιστική και αντινεοπλασματική δράση, ασκούν δε τη δράση τους αυτή μετά από μεταγραφική επαγωγή διάφορων γονιδίων-στόχων. Κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφικής επαγωγής των ιντερφερονών παίζουν τα κυτταρικά «μονοπάτια» των παραγόντων JAK – STAT και η οικογένεια των Interferon Regulated Factors (IRFs). Ο IRF-1 είναι ογκοκατασταλτικό γονίδιο και επάγει τη μεταγραφή γονιδίων απαραίτητων για τη ανάπτυξη, διαφορο- ποίηση και απόπτωση του κυττάρου. Πρόσφατες μελέτες σε ασθενείς με μυε- λοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) και οξεία μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ) έδει- ξαν ότι ελλείμματα των εξονίων 2 ή 2 και 3, καθώς επίσης και διαταραχή της σχέσης IRF1/IRF2, αποτελούν πιθανούς μηχανισμούς της ογκογένεσης. Επίσης, ο IRF-1 αποτελεί κύριο ρυθμιστή της TH1 ανοσολογικής ανταπόκρισης, συνδέ- οντας έτσι την κακοήθεια με την ανοσολογική ανταπόκριση. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος πιθανών γενε- τικών μεταβολών του IRF-1, τόσο στην παθογένεια της χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας (ΧΜΛ), όσο και την εξέλιξή της, καθώς και στην ανταπόκριση της νόσου στη θεραπευτική χορήγηση ιντερφερόνης, η οποία και αποτελεί θεραπεία εκλογής στη χρόνια φάση της νόσου. Επίσης, σκοπός ήταν να μελετηθεί και ο πιθανός ρόλος του IRF-1 στην ανοσολογική συμπεριφορά των μυελοδυσπλα- στικών συνδρόμων (ΜΔΣ), μιας και είναι γνωστό ότι στο 10-15% των ασθενών με ΜΔΣ παρατηρούνται αυτοάνοσες εκδηλώσεις. Μελετήθηκε το γονίδιο IRF-1 σε στοιβάδα μονοπύρηνων κυττάρων περι- φερικού αίματος σε 21 ασθενείς σε χρόνια φάση ΧΜΛ και 14 ασθενείς με ΜΔΣ (7 χωρίς και 7 με αυτοάνοσες εκδηλώσεις). Για καλύτερη ερμηνεία και αξιολό- γηση των αποτελεσμάτων, μελετήθηκαν 10 φυσιολογικοί ενήλικες και 4 ασθε- νείς με λευχαιμία από τριχωτά κύτταρα που βρίσκονταν υπό θεραπεία με ιντερ- φερόνη-α. Στους ασθενείς με ΧΜΛ μελετήθηκε και το γονίδιο IRF-2, καθώς και η σχέση IRF-1/IRF-2. Έγινε ανίχνευση μεταλλάξεων του IRF-1 με τη χρησιμοποίηση της μεθόδου NIRCA (Non Isotopic RNase Cleavage Assay), ενώ για την ανάλυση της έκφρασης τόσο του IRF-1 mRNA, όσο και του IRF-2 mRNA χρη- σιμοποιήθηκε το QuantumRNA classic II 18S Kit (Ambion - Austin, TX, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η μέθοδος είναι ημιποσοτική και χρησιμοποιήθηκε το 18S rRNA ως εσωτερικός μάρτυρας.