Αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα, στρωματικά κύτταρα, δείκτες κυτταρικής ενεργοποίησης και απόπτωσης στον μυελό των οστών ασθενών με αυτοάνοση ηπατίτιδα τύπου Ι και πρωτοπαθή χολική κίρρωση

Abstract

The aims of the present study were: · To determine the morphological abnormalities of bone marrow aspirates by investigating bone marrow smears from these patients. · To investigate whether hemopoietic progenitor cells and bone marrow stromal cells are affected in patients with AIH-1 and PBC. · To investigate the markers of apoptosis and cell activation in bone marrow mononuclear cells of these patients. · To investigate the bone marrow microenvironment in these autoimmune liver diseases by studying bone marrow cytokine production in long-term cultures of bone marrow mononuclear cells. We studied 13 AIH-1 patients and 13 PBC patients. As control groups we investigated 12 cirrhotic patients with histologically proven cirrhosis of non-autoimmune etiology (disease control group) and ten healthy controls (healthy control group). Morhological abnormalities were evaluated with hematoxylin and eosin and May-Grawnwald/Giemsa stain, as well as Perls’s stains. Flow cytometry, expansion cultures, long-term bone marrow cultures and clonogenic progenitor cell assays were used. Stromal cell function was assessed in long term bone marrow cultures recharged with normal CD34+ cells. Apoptotic markers and CD14 expression were also evaluated while TNF-α, TGF-β, IFN-γ, IL-4 and IL-10 were determined using ELISAs. Regarding bone marrow findings, bone marrow cellularity was abnormal in many patients and cirrhotic controls. Bone marrow plasmacytosis was observed more frequently in AIH-1 compared to PBC and cirrhotic controls. AIH-1 patients had increased CD34+, CD34+/CD38+ and CD34+/CD38- cells compared to all groups. PBC patients had lower progenitor cells compared to controls. No differences were found between cirrhotic controls and healthy controls. Committed progenitor cells in non-adherent cell fraction were increased in AIH-1 patients but decreased in PBC compared to controls. Stromal cells failed to support normal hemopoiesis in PBC. All apoptotic markers and CD14 were increased in AIH-1 and PBC patients compared to controls. Fas+ cells were positively correlated with apoptotic cells in AIH-1 and PBC. TNF-α and IFN-γ were higher in AIH-1 and PBC compared to controls. No differences were found between the control group.IL-4 and TGF-β were found significantly increased in the bone marrow of PBC patients compared to AIH-1 patients and both control groups. AIH-1 patients had significantly higher bone marrow IL-10 compared to PBC patients and higher IL-10, IL-4 and TNF-α compared to controls. In AIH-1 patients, IL-10 was positively correlated with CD34+, CD34+/CD38- and CD34+/CD38+ cell proportions. We demonstrated for the first time that AIH-1 patients had increased hemopoietic progenitor cells and normal stromal function while in PBC patients progenitor cells and the bone marrow microenvironment were defective. Our data could support the concept that AIH-1 patients with severe and/or refractory disease to conventional immunosuppression might be apropriate candidates for autologous stem cell transplantation while in PBC we may have difficulties in the procedure since bone marrow progenitor and stromal cell abnormalities might impact on the harvesting and engrafment potential of stem cells. We also showed for the first time that the apoptotic process, macrophage activation and the production of cytokines suppressors of hematopoiesis in bone marrow mononuclear cells from AIH-1 and PBC patients are higher compared to controls. The Fas-FasL pathway is likely to be involved in the apoptotic process. The production of cytokines suppressors of hemopoiesis in bone marrow mononuclear cells may contribute to the increased apoptotic process via the stimulation of Fas-FasL pathway leading to the decresed bone marrow cellularity in the one fifth of the whole number of patients with autoimmune liver diseases. These findings seem unlikely to be attributed to the cirrhotic process, as cirrhotic controls did not differ from healthy controls. The implication of the bone marrow in the pathogenesis of autoimmune liver diseases is possible and needs further studies in order to eludicate whether intensive immunosuppression to eradicate autoreactive lymphocytic clones, followed by autologous stem cell transplantation could be a treatment option in refractory cases of liver autoimmunity.

Στόχοι της παρούσης εργασίας ήταν η μελέτη των διαταραχών του αιμοποιητικού συστήματος σε πάσχοντες από ΑΗ-1 και ΠΧΚ και η διερεύνηση της δυνατότητας υποστήριξης της αιμοποίησης από το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών σε περίπτωση αυτόλογης μεταμόσχευσης αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων. Στην προσπάθεια αυτή έγινε μελέτη των ποσοτικών και ποιοτικών διαταραχών των αιμοποιητικών κυττάρων και των προβαθμίδων τους στον μυελό των οστών και μελέτη των λειτουργικών διαταραχών των αιμοποιητικών κυττάρων και των κυττάρων του στρώματος του μυελού των οστών. Μελετήσαμε 13 ασθενείς με ΑΗ-1 και 13 ασθενείς με ΠΧΚ. Την ομάδα ελέγχου αποτέλεσαν 12 κιρρωτικοί με μη αυτοάνοσης αιτιολογίας κίρρωση και 10 υγιείς. Οι μορφολογικές ανωμαλίες του μυελού μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη/ηωσίνη, χρώση May-Grawnwald /Giemsa και χρώση Perl. Τα CD34+ κύτταρα μελετήθηκαν με κυτταρομετρία ροής, καλλιέργειες ανάπτυξης, καλλιέργειες μυελού των οστών μακράς διαρκείας, έγινε μελέτη των κλωνογόνων προγονικών κυττάρων και καλλιέγειες ενός κυττάρου. Επίσης μελετήθηκε η λειτουργία των στρωματικών κυττάρων, οι δείκτες απόπτωσης, η έκφραση του CD14 και οι κυτταροκίνες TNF-α, TGF-β και IFN-γ, IL-4, IL-10 σε υπερκείμενα μακράς διάρκειας καλλιεργειών των λεμφομονοκυττάρων του μυελού των οστών. Όσον αφορά τα μορφολογικά ευρήματα αυξημένα πλασματοκύτταρα μυελού παρατηρήθηκαν στο 1/3 ασθενών με ΑΗ-1, σε έναν ασθενή με ΠΧΚ και σε έναν κιρρωτικό μάρτυρα. Οι ασθενείς με ΑΗ-1 είχαν σημαντικά αυξημένο αριθμό CD34+, CD34+/CD38+ και CD34+/CD38- κυττάρων σε σχέση με τους ασθενείς με ΠΧΚ και τους μάρτυρες (κιρρωτικούς και υγιείς) ενώ οι ασθενείς με ΠΧΚ είχαν σημαντικά χαμηλότερο αριθμό σε σχέση με τους μάρτυρες. Δεν βρέθηκαν διαφορές ανάμεσα σε κιρρωτικούς και υγιείς. Στις μακράς διάρκειας καλλιέργειες του μυελού των οστών ο αριθμός των αιμοποιητικών αποικιών στο εναιωρούμενο κυτταρικό κλάσμα ήταν σημαντικά υψηλότερος στην ΑΗ-1 και σημαντικά χαμηλότερος στην ΠΧΚ σε σχέση με τους μάρτυρες. Tα στρωματικά κύτταρα δεν υποστήριξαν την αιμοποίηση μόνο στους ασθενείς με ΠΧΚ. Όλοι οι αποπτωτικοί δείκτες και τα CD14 ήταν αυξημένα στους ασθενείς με ΑΗ-1 και ΠΧΚ σε σχέση με τους υγιείς και τους κιρρωτικούς. O TNF-α και η IFN-γ ήταν υψηλότερα στην ΑΗ-1 και στην ΠΧΚ σε σχέση με τους μάρτυρες. Δεν βρέθηκαν διαφορές ανάμεσα σε υγιείς και κιρρωτικούς. Η ΙL-4 και ο TGF-β βρέθηκαν σημαντικά αυξημένοι στο μυελό των οστών με ΠΧΚ σε σχέση με τους ασθενείς με ΑΗ-1 και τους υγιείς μάρτυρες και κιρρωτικούς. Οι ασθενείς με ΑΗ-1 είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα IL-10 στον μυελό των οστών σε σχέση με τους ασθενείς με ΠΧΚ και υψηλότερα επίπεδα ΙL-10, IL-4 και ΤΝF-α σε σχέση με τους μάρτυρες.Συμπερασματικά, δείξαμε για πρώτη φορά ότι στην ΑΗ-1 τα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα είναι σημαντικά αυξημένα σε σχέση με τους υγιείς και τα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών υποστηρίζουν την αιμοποίηση. Αντιθέτως στους ασθενείς με ΠΧΚ και τα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα και το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών βρέθηκαν σημαντικά επηρεασμένα αρνητικά. Από κλινικής απόψεως τα δεδομένα αυτά μπορούν να υποστηρίξουν την υπόθεση ότι οι ασθενείς με σοβαρές μορφές ΑΗ-1 ή ανθεκτικές μορφές στα ανοσοκατασταλτικά θα μπορούσαν να είναι κατάλληλοι υποψήφιοι για αυτόλογη μεταμόσχευση μυελού. Επίσης, η αποπτωτική διαδικασία, η ενεργοποίηση των μονοκυττάρων και η παραγωγή κυτταροκινών που καταστέλλουν την αιμοποίηση στα λεμφομονοπύρηνα κύτταρα του μυελού των οστών ασθενών με ΑΗ-1 και ΠΧΚ είναι υψηλότερες σε σχέση με τους μάρτυρες. Ο μηχανισμός Fas-FasL πιθανόν εμπλέκεται στην αποπτωτική διαδικασία. Τα αυξημένα επίπεδα κάποιων κυτταροκινών πιθανόν να οδηγούν στην διέγερση του μηχανισμού Fas-FasL. Επίσης, η αυξημένη συγκέντρωση των κυτταροκινών που καταστέλλουν την αιμοποίηση πιθανόν να ευθύνεται για την μειωμένη κυτταροβρίθεια που παρατηρείται σε κάποιους ασθενείς μέσω της οδού Fas-FasL. Τα ευρήματα αυτά δεν φαίνεται να σχετίζονται με την κίρρωση, αφού δεν υπήρχαν διαφορές ανάμεσα σε κιρρωτικούς και υγιείς μάρτυρες. Τα στοιχεία μας ίσως βοηθήσουν στην διερεύνηση εάν εντατική ανοσοκατασταλτική θεραπεία ακολουθούμενη από αυτόλογη μεταμόσχευση είναι μια εναλλακτική επιλογή σε ανθεκτικές μορφές αυτοανοσίας του ήπατος.