Μοριακή ταυτοποίηση και τυποποίηση του δερματόφυτου trichophyton rubrum. Περιγραφική και μοριακή επιδημιολογία αυτού

Abstract

Τhe anthropophilic dermatophyte Trichophyton rubrum constitutes the commonest and clinically most important dermatophyte in Greece and the rest of the world. Currently, the diagnosis of the diseases caused by T. rubrum is based on the demonstration of fungal structures in direct microscopy of clinical specimens plus culturing and identification of the species. These methods are time consuming and of low sensitivity, also requiring considerable expertise. Intensification of the genomic study of dermatophytes in recent years, has created considerable interest on developing molecular methods for their typing, detection and identification. The aims of this thesis were a) to record, for the first time, the whole range of phenotypic variants of the T. rubrum strains isolated in Greece, b) to determine the molecular subtypes of the Greek T. rubrum strains in comparison to the subtypes of strains from the Balkans and other geographic regions, c) to investigate the current theory claiming ‘clonal’ derivation of T. rubrum, and d) to design and develop a multiplex real-time PCR assay for rapid direct detection and identification of T. rubrum in clinical specimens. The phenotypic variants of the T. rubrum strains were determined by the study of their morphology and their biochemical and physiological characteristics. Emphasis was especially given to the detection of T. rubrum variants not yet described in Greece and to comparison of the Greek T. rubrum variants with those isolated from other Balkan countries (Bulgaria), Europe, Asia and Africa. All strains were examined with two molecular typing methods, a) ribotyping of the intergenic ribosomal spacer IGS, and b) PCR-SSCP of urease gene sequences. A representative number of strains were examined with PCR-SSCP of the Internal Transcribed Spacers ITS1 & ITS2 as well as part of the mitochondrial ribosomal gene ML. Expression of urease gene was also tested. With the aim of rapid direct detection and identification of T. rubrum and the major pathogenic dermatophytes in clinical specimens, a system of two multiplex real-time PCR reactions was designed, one reaction amplifying the whole of the ITS1 and detecting the T. mentagrophytes complex, T. tonsurans and T. violaceum and the second amplifying the whole of the ITS2 and detecting the T. rubrum complex, M. canis and M. audouinii. The assays were performed using Taqman and minor groove binding probes carrying different fluorophores to discriminate targets. Seven T. rubrum variants were detected in Greece, the cottony-velvety, the flavum, the nigricans, the ‘hyalinum’, the ‘hyperpigmented’, the ‘aurantiacum’ and the African - ‘T. raubitschekii’ variant. In Bulgaria, the cottony-velvety, the flavum, the ‘hyalinum’, the ‘hyperpigmented’ and the African-‘T. raubitschekii’ were recorded. All T. rubrum strains were found genomically homogeneous with the typing methods tested, the reported in the literature ‘clonal’ nature of the microorganism. The real-time PCR system correctly identified all aforementioned dermatophyte species from pure culture. The analytical sensitivity of both assays and for each species was 0.1 pg, corresponding to 2,5-3,3 genomes per sample. The system detected all microscopy and/or culture positive samples (40), correctly identifying all the species (T. rubrum, T. mentagrophytes, M. audouinii, T. violaceum) grown in culture (n=29). It also detected 7 additional positive samples that were negative by microscopy/culture and identified 2 mixed infections, both by T. rubrum and T. mentagrophytes. The documentation of the T. rubrum variants showed that the T. rubrum variant distribution in Greece is similar to the distribution in Western Europe and the Balkans and differs from the distribution of the microorganism variants in Africa and Asia. The existence of ‘T. raubitschekii’ (which can be regarded as the ‘maternal’ form of T. rubrum) in Greece and Bulgaria was reported for the first time in the context of this thesis. The molecular typing of T. rubrum confirmed its extraordinary genomic homogeneity, referred in the literature to as ‘clonality’ of the microorganism, a finding that can be related to the recent evolution of the dermatophyte. The proposed real-time PCR assay, reported here for the first time, has a high sensitivity, enables accurate diagnosis of T. rubrum and of five other commonly encountered dermatophyte species and it could be potentially incorporated in the clinical laboratory routine diagnostic methodology.

Το ανθρωπόφιλο δερματόφυτο Trichophyton rubrum αποτελεί το συνηθέστερο και κλινικά σημαντικότερο δερματόφυτο τόσο διεθνώς όσο και στην Ελλάδα. Η σύγχρονη διάγνωση των λοιμώξεων αυτών βασίζεται στην άμεση μικροσκόπηση των κλινικών δειγμάτων καθώς και στην καλλιέργεια και ταυτοποίηση των απομονούμενων δερματοφύτων. Η διαδικασία αυτή είναι χρονοβόρα, χαμηλής ευαισθησίας και απαιτεί εξειδικευμένο προσωπικό. Η γονιδιωματική μελέτη τωνδερματοφύτων των τελευταίων ετών έχει δημιουργήσει ενδιαφέρον για την ανάπτυξη μοριακών μεθόδων για την τυποποίηση, ανίχνευση και ταυτοποίηση αυτών. Στόχοι της διατριβής ήταν α) η καταγραφή, για πρώτη φορά, ολοκλήρου του φάσματος των φαινοτυπικών ποικιλιών των ελληνικών στελεχών T. rubrum, β) ο προσδιορισμός των μοριακών υποτύπων των Ελληνικών στελεχών του T. rubrum σε σύγκριση με υποτύπους στελεχών από τα Βαλκάνια και ποικίλης γεωγραφικής προέλευσης (π.χ. Βρετανία, Γκαμπόν), γ) η διερεύνηση της θεωρίας της κλωνικής προέλευσης του δερματοφύτου και δ) ο σχεδιασμός ταχείας μεθοδολογίας άμεσης ανίχνευσης και ταυτοποίησης του T. rubrum με χρήση της πολυπλεκτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου ανάγνωσης. Οι φαινοτυπικές ποικιλίες των ελληνικών στελεχών T. rubrum προσδιορίστηκαν μεμελέτη της μορφολογίας και των βιοχημικών και φυσιολογικών χαρακτήρων αυτών με ιδιαίτερη έμφαση στην αναζήτηση ποικιλιών που δεν έχουν περιγραφεί στον ελληνικό γεωγραφικό χώρο και σύγκριση των ελληνικών φαινοτυπικών ποικιλιών με αυτές Βαλκανικών (Βουλγαρικών) και Ευρωπαϊκών, Ασιατικών και Αφρικανικών στελεχών T. rubrum. Το σύνολο των στελεχών εξετάστηκε με δύο διαφορετικές μεθόδους, με ριβοτυπία της διαγονιδιακής ριβοσωμικής περιοχής IGS και με PCRSSCP αλληλουχιών του γονιδίου της ουρεάσης και τον έλεγχο έκφρασης του γονιδίου της ουρεάσης με αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης. Επίσης έγινε προκαταρκτική-διερευνητική εξέταση με PCR-SSCP, ολόκληρων των ριβοσωμικών μεταγραφόμενων περιοχών ITS και περιοχών του μιτοχονδριακού ριβοσωμικού γονιδίου ML επί αντιπροσωπευτικού αριθμού στελεχών. Με στόχο την άμεση ανίχνευση και ταυτοποίηση του T. rubrum και των λοιπών κλινικά σημαντικάδερματοφύτων (T. mentagrophytes, T. violaceum, T. tonsurans, M. canis, M. audouinii) από κλινικό υλικό, σχεδιάστηκε ένα σύστημα δύο πολυπλεκτικών αντιδράσεων PCR πραγματικού χρόνου ανάγνωσης. Η πρώτη αντίδραση ενισχύει την περιοχή ITS1 και ανιχνεύει το σύμπλεγμα ειδών του Trichophyton mentagrophytes, το T. tonsurans και το T. violaceum και η δεύτερη ενισχύει την περιοχή ITS2 και ανιχνεύει το σύμπλεγμα ειδών του T. rubrum, το Microsporum canis και το M. audouinii. Και οι δύο αντιδράσεις κάνουν χρήση ιχνηθετών υβριδισμού Taqman και MGB (minor groove binding) που φέρουν διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές για το διαχωρισμό των διαφόρων στόχων. Στον Ελληνικό χώρο ανευρέθηκαν 7 ποικιλίες του T. rubrum, η χνοώδης-βελούδινη ποικιλία, η κίτρινη, η άχροη, η υπέρχροη, η μελανινογόνος, η χρυσίζουσα και η κοκκώδης-T. raubitschekii. Στον Βουλγαρικό χώρο ανευρέθηκαν η χνοώδης- βελούδινη, η κίτρινη, η άχροη, η υπέρχροη και η κοκκώδης - T. raubitschekii. Όλα τα στελέχη T. rubrum αναδείχθηκαν μοριακώς ομοιογενή με τις τυποποιητικές μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν, επιβεβαιώνοντας την «κλωνική» φύση του μικροοργανισμού. Το σύστημα πολυπλεκτικής PCR ανίχνευσε και ταυτοποίησε ορθά όλα τα προαναφερόμενα είδη, από καθαρά καλλιεργήματα. Η αναλυτική ευαισθησία και των δύο αντιδράσεων ήταν 0.1 pg, που αντιστοιχεί σε 2,5-3,3 γονιδιώματα δερματοφύτου ανά δείγμα. Όλα τα δείγματα με θετική μικροσκοπική εξέταση ή/και θετική καλλιέργεια (n=40) ήταν θετικά κατά την εξέταση με PCR και επίσης τα είδη (T. rubrum, T. mentagrophytes, M. audouinii, T. violaceum) από θετικές καλλιέργειες ταυτοποιήθηκαν ορθά (n=29). Το σύστημα επίσης ανίχνευσε 7 πρόσθετα θετικά δείγματα που ήταν αρνητικά στη μικροσκόπηση/καλλιέργεια και βρήκε 2 μικτές λοιμώξεις από T. rubrum και T. mentagrophytes. Η καταγραφή των φαινοτυπικών ποικιλιών του T. rubrum έδειξε ότι η κατανομή των ποικιλιών του δερματοφύτου στη χώρα μας είναι η ίδια με την κατανομή του στην Δυτική Ευρώπη και τα Βαλκάνια και διαφορετική από την κατανομή του στην Αφρική και Ασία. Στα πλαίσια αυτά καταγράφηκε για πρώτη φορά η ύπαρξη στον Ελληνικό και Βαλκανικό χώρο της ποικιλίας «Τ. raubitschekii», που μπορεί να θεωρηθεί ως η μητρική μορφή του T. rubrum. Η μοριακή τυποποίηση του δερματοφύτου T. rubrum ανέδειξε στοιχεία γονιδιωματικής σταθερότητας (αποδιδόμενη σε κλωνικότητα από τη διεθνή βιβλιογραφία), εύρημα που μπορεί να αποδοθεί στην πρόσφατη εξέλιξη του δερματοφύτου. Επιπλέον, για πρώτη φορά διεθνώς, εκπονήθηκε μεθοδολογία πολυπλεκτικής PCR πραγματικού χρόνου ανάγνωσης για την απευθείας ανίχνευση και ταυτοποίηση του T. rubrum καθώς και πέντε άλλων κλινικά σημαντικών δερματοφύτων από κλινικό υλικό. Η μεθοδολογία αυτή παρουσιάζει καλές προοπτικές υιοθέτησής της στο καθημέρα διαγνωστικό εργαστήριο των δερματοφυτικών λοιμώξεων.