Ανίχνευση άμεσων γονιδίων - στόχων του μεταγραφικού παράγοντα ERF

Abstract

Erf is an ETS-domain protein with strong transcriptional repressor activity that represses transcription through a distinct C- terminus located repressor domain. The 2.8 kb Erf mRNA encodes for an 80 kDa phosphoprotein that is ubiquitously expressed in the developing mouse embryo and adult tissues as well as in all cell lines tested, except for the placenta. Erf is an effector of the Ras/MAPK signaling pathway that is regulated through direct Erk phosphorylation. Erf-Erk physical interaction is mediated through two FXF motifs, lying at the central part of the Erf protein. Both are required for the interaction with the active form of Erk, while only one is sufficient for the binding to the non-phosphorylated form of Erk, although with less affinity. Erf is phosphorylated by Erk in multiple serine and threonine residues within the nucleus. Concomitantly, this phosphorylation determines its subcellular localization and thus its function as a transcriptional repressor. After mitogenic stimulation Erf is phosphorylated by Erk and exported from the nucleus to the cytoplasm, while in the absence of mitogenic stimulation, Erf is accumulating in the nucleus in a non-phosphorylated state. Phosphorylation-deficient and Erk-binding-deficient Erf mutants are primarily nuclear, irrespective of the growth conditions and Erk activity and can arrest cell cycle at the G0/G1 phase, further confirming that Erf constitutes a bona-fide Erk substrate and Ras/Erk pathway effector. It has also been suggested that the Erf mediated cell cycle arrest is Rb-dependent and is abolished in the overexpression of cyclins D1 and E. Erf can also act as a tumor suppressor since it has been shown that can suppress ets- and ras- induced tumorigenicity as well as Ewing’s sarcoma in cellular and murine systems. Recent findings from the analysis of the Erf knockout mouse suggest that Erf plays significant role in the placenta development. Erf KO mice die at 10.5dpc, due to severe placenta malformation. During placenta development, Erf is expressed in the trophoblast stem cells of the extraembryonic ectoderm and in later stages in the chorion diploid cells and the labyrinthine trophoblasts. Erf -/- placentas exhibit compact chorion layer, absence of labyrinth, expanded giant cell layer and diminished spongiotrophoblast layer. Marker analysis for different cell types of the trophoblast lineage by in situ hybridization, indicated that Erf -/- placentas lack post- mitotic chorion cells as well as the terminal differentiated labyrinthine cell type, thesyncytiotrophoblasts, while they show prolonged expression of trophoblast stem cell (TSC) markers, like Errb. These data suggest that loss of Erf may block terminal differentiation of the chorion diploid cells. Although much is known about Erf regulation through the Ras/Erk pathway and its physiological role in vivo, there is no evidence for cellarer direct Erf transcriptional targets. In this study we used microarrays to identify genes that are directly regulated by Erf. Fourteen genes were characterized as potential direct Erf targets, with Olig1 and c-Myc genes being the most prominent. These genes were shown to be upregulated in the absence of Erf and serum in primary fibroblasts, while c-Myc is increased in Erf KO embryos and placentas. Conversely, Erf overexpression could downregulate c-Myc gene, in conditions that Erf is nuclear and inhibits the transformation of the MCF-7 adenocarcinoma cell line. Furthermore, endogenous Erf could bind the 5’ upstream regions of c-Myc in serum-starved fibroblasts and regulate its promoter activity, suggesting that c-Myc is a direct Erf target gene. Erf is totally unable to inhibit cell proliferation in the absence of c-Myc, showing that c-Myc is downstream of Erf in the regulation of the cell cycle. Finally, in Rb-/-fibroblasts, c-Myc is marginally expressed and cannot be regulated by Erf. Together these data show that Erf functions are mediated through the direct regulation of the c-Myc gene. In an effort to characterise proteins that regulate Erf activity, a yeast two-hybrid screen was performed in the lab. Hipk1 nuclear kinase emerged as one potential interactant protein and this interaction was further analysed. Erf wt, as well as the nuclear mutant form of Erf, interact preferentially with Hipk1 in mammalian cells, through its aminoterminal region. Both Hipk1 and Hipk2 phosphorylate this part of Erf, but not a portion of the Erf protein consisting of the Erk-interaction domain and the C-terminus. However, we failed to identify specific residues that are phosphorylated by the Hipks. Functionally, Hipk-mediated phosphorylation leads to partial Erf export to the cytoplasm of fibroblasts and concomitantly to loss of Erf transcriptional repression activity at both artificial and native promoters. The biological significance of the Erf-Hipk interaction is still unclear, although it is speculated that it may play a role in the development of the neural tube by regulating Olig1 expression.

Ο ERF (Ets-2 Repressor Factor) είναι μεταγραφικός καταστολέας της οικογένειας των ETS γονιδίων, ο οποίος ρυθμίζεται από το μονοπάτι Ras/Erk. Το 2.8kb mRNA του Erf εκφράζεται ομοιόμορφα σε όλους τους ιστούς και τις κυτταρικές σειρές που έχουν μέχρι τώρα ελεγχθεί, εκτός από το πλακούντα. Αλληλεπιδρά in vitro και in vivo ειδικά με την Erk κινάση, τόσο με την ενεργό φωσφωρυλιωμένη μορφή της όσο και με την ανενεργή. Αυτή η αλληλεπίδραση διαμεσολαβείται από δύο ξεχωριστά FXF μοτίβα στο κεντρικό τμήμα της Erf πρωτεΐνης, χαρακτηριστικά των υποστρωμάτων της Erk. Τα δύο αυτά μοτίβα δείχνουν διαφορετική προτίμηση για την πρόσδεση με την ενεργό ή την ανενεργό Erk κινάση, όπως έχει φανεί από ανάλυση σημειακών μεταλλαγών. Η ενεργός Erk, ωστόσο, αλληλεπιδρά με τον Erf με 5 περίπου φορές ισχυρότερη συγγένεια πρόσδεσης σε σχέση με την ανενεργό μορφή της. Η Erk-διαμεσολαβούμενη φωσφωρυλίωση του Erf έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή του υποκυτταρικού εντοπισμού του. Έτσι, η φωσφωρυλιωμένη μορφή του Erf (κάτω από συνθήκες που η Erk είναι ενεργή) βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα, ενώ όταν το Ras/Erk μονοπάτι αναστέλλεται, τότε ο Erf συσσωρεύεται γρήγορα στον πυρήνα, αποφωσφωρυλιώνεται και ασκεί τη δράση του ως μεταγραφικός παράγοντας. Μεταλλαγμένη μορφή του Erf, στην οποία και οι εφτά θέσεις φωσφωρυλίωσης έχουν μεταλλαχθεί σε αλανίνη (Erf M1-7), καθιστά την πρωτεΐνη μονίμως πυρηνική. Αντίστοιχο φαινότυπο δείχνει και η μεταλλαγμένη μορφή του Erf που είναι ελαττωματική για την πρόσδεση στην Erk κινάση, αποδεικνύοντας ότι ο Erf είναι ειδικό υπόστρωμα της Erk. Υπερέκφραση της Erf M1-7 πρωτεΐνης σε ινοβλάστες οδηγεί τα κύτταρα σε αναστολή του κυτταρικού τους κύκλου στη φάση G1, ενώ η αγρίου τύπου πρωτεΐνη δεν έχει επίδραση. Η δράση αυτή εξαρτάται άμεσα από την παρουσία της πρωτεΐνης του Ρετινοβλαστόματος, αφού κύτταρα με έλλειψή της δεν αναστέλλονται από την Erf M1-7, ενώ η υπερέκφραση των κυκλινών D1 και E αναιρεί τη ανασταλτική δραστηριότητα του Erf. Επιπλέον, η Erf M1-7 πρωτεΐνη, όπως και η ελαττωματική, ως προς τη δέσμευση με την Erk, πρωτεϊνη του Erf αντιστρέφει το Ras-επαγόμενο μετασχηματισμό των ινοβλαστών, παρέχοντας ενδείξεις ότι ο Erf μπορεί να έχει ογκοκατασταλτική λειτουργία, πέρα από το φυσιολογικό κυτοστατικό του ρόλο. Η δημιουργία στο εργαστήριο ποντικών με έλλειψη του Erf παρείχε περαιτέρω στοιχεία για την in vivo δραστηριότητά του. Τα Erf-/- ποντίκια δεν είναι βιώσιμα πέρα από το στάδιο 10-10.5dpc της εμβρυικής ζωής, εξαιτίας σοβαρών προβλημάτων στην ανάπτυξη του πλακούντα. Συγκεκριμένα, στους πλακούντες των Erf-/- εμβρύων παρατηρείται μία συμπαγής χοριακή στοιβάδα, αγενεσία του λαβυρίνθου, μία εκτεταμένη στοιβάδα γιγαντιαίων κυττάρων και μία μικρότερη σπογγώδης στοιβάδα. Επίσης, παρατηρείται απουσία των μεταμιτωτικών κυττάρων του χορίου και των συγκυτιοκυττάρων που αποτελούν τα τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα του λαβυρίνθου. Αντίθετα, υπάρχει αυξημένη έκφραση γονιδίων-δεικτών των αρχέγονων τροφοβλαστικών κυττάρων που παραμένουν αδιαφοροποίητα. Επομένως, ο Erf φαίνεται ότι συμμετέχει στη διαφοροποίηση των τροφοβλαστικών κυττάρων και την ανάπτυξη συγκεκριμένων κυτταρικών τύπων που οδηγούν στην πλακουντογένεση. Ενώ η ρύθμιση και ο φυσιολογικός ρόλος του Erf έχουν αρχίσει να αποκαλύπτονται, ελλιπής είναι η γνώση σχετικά με τα γονίδια-στόχους του και το μοριακό μηχανισμό δράσης του. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήθηκε προσπάθεια ταυτοποίησης των γονιδίων που ρυθμίζει άμεσα ο Erf και ανίχνευσης του μηχανισμού μεταγραφικής καταστολής. Δημιουργήθηκαν πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες από εμβρυικούς ινοβλάστες ποντικών αγρίου τύπου ή με έλλειψη του Erf και αναπτύχθηκαν είτε σε πλήρες θρεπτικό υλικό (ανενεργός Erf), είτε σε απουσία ορού για τέσσερεις ώρες (ενεργός Erf). Στη συνέχεια έγινε σύγκριση των μεταγραφικών προτύπων τους με υβριδοποίηση μικροσυστοιχειών cDNA. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων αποκάλυψε 14 συνολικά γονίδια των οποίων η έκφραση αυξάνεται ελλείψει του Erf, σε συνθήκες που αυτός βρίσκεται στον πυρήνα των κυττάρων και είναι ενεργός (δηλαδή απουσία ορού). Δύο από αυτά, το c-Myc και το Olig1, διερευνήθηκαν περαιτέρω αν αποτελούν άμεσους στόχους του Erf. Το c-Myc επιλέχθηκε διότι είναι συμβατό με τη μέχρι στιγμής γνωστή λειτουργία και τη ρύθμιση του Erf και το Olig1 επειδή έδειξε την υψηλότερη ενεργοποίηση απουσία του Erf (περίπου 5,5 φορές). Αφού επιβεβαιώθηκε, με ημιποσοτική αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου (RT-qPCR), ότι τα επίπεδα του mRNA του c-Myc αυξάνονται απουσία του Erf, δείχθηκε με ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης και qPCR ότι ο ενδογενής Erf προσδένεται στον υποκινητή του c-Myc σε συνθήκες έλλειψης ορού. Επιπρόσθετα σύγκριση αγρίου τύπου με Erf-/- εμβρύων και πλακούντων έδειξε υπερέκφραση του c-Myc ελλείψει του Erf. Επιπλέον, με δοκιμασία λουσιφεράσης φάνηκε ότι ο Erf αγρίου τύπου καταστέλλει την, καθοδηγούμενη από το c-Myc υποκινητή, μεταγραφή σε συνθήκες έλλειψης ορού. Η δράση αυτή εξαρτάται από την κατασταλτική περιοχή του Erf και την περιοχή πρόσδεσης στο DNA, συνιστώντας μία άμεση και ενεργή δράση του Erf στη μεταγραφική καταστολή του c-Myc. Επαγόμενη υπερέκφραση του αγρίου τύπου Erf ή του Erf M1-7 σε ινοβλάστες προκαλεί τη μείωση του c-Myc mRNA σε συνθήκες έλλειψης ορού ή και σε κανονικές συνθήκες αύξησης, αντίστοιχα. Υπερέκφραση του Erf M1-7 αλλά όχι και του Erf wt στα Ras- μετασχηματισμένα κύτταρα οδηγεί σε μείωση του c-Myc mRNA, παρέχοντας μία ένδειξη ότι το c-Myc βρίσκεται καθοδικά του Erf. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας σταθερά διαμολυσμένα MCF7 κύτταρα, των οποίων ο μετασχηματισμός εξαρτάται από το c-Myc, δείχθηκε ότι ο Erf Μ1-7 ελαττώνει το c-Myc mRNA και αντιστρέφει το μετασχηματισμένο φαινότυπο σε συνθήκες μειωμένου ορού. Τέλος, για να διαλευκανθεί γιατί ο Erf δεν αναστέλλει τον κυτταρικό κύκλο απουσία του Rb, ελέγχθηκαν τα επίπεδα του c-Myc mRNA και η πρόσδεση του Erf στον υποκινητή του. Έτσι φάνηκε ότι απουσία ορού τα επίπεδα του c-Myc mRNA δεν μειώνονται στα Rb-/- κύτταρα (αν και είναι ήδη πολύ χαμηλά σε σχέση με τα αγρίου τύπου κύτταρα), ενώ συγχρόνως ο Erf δεν μπορεί να αλληλεπιδράση με τον υποκινητή του c-Myc ανεξάρτητα από τις συνθήκες ανάπτυξης. Τα παραπάνω, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι σε ινοβλάστες με έλλειψη του c-Myc, η Erf Μ1-7 πρωτεΐνη δεν μπορεί να αναστείλει τον κυτταρικό κύκλο, παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι ο υποκινητής του c-Myc γονιδίου αποτελεί άμεσο στόχο του Erf μεταγραφικού καταστολέα και εξηγούν το μηχανισμό της φυσιολογικής δράσης του Erf. Παράλληλα, επιβεβαιώθηκε ότι και το Olig1 mRNA αυξάνεται απουσία του Erf σε συνθήκες έλλειψης ορού. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της χρωματίνης έδειξαν ότι ο Erf αλληλεπιδρά in vivo με τον υποκινητή του Olig1, απουσία ορού. Εν συνεχεία κλωνοποιήθηκε η 5’ περιοχή του γονιδίου και δείχθηκε με δοκιμασίες λουσιφεράσης, αφενός ότι παρουσιάζει μεταγραφική ενεργότητα και αφετέρου ότι ο Erf καταστέλλει αυτή την ενεργότητα με ένα TSA-εξαρτώμενο τρόπο. Τα παραπάνω αποτελούν ενδείξεις ότι ο Erf ρυθμίζει άμεσα τον Olig1 υποκινητή, ωστόσο περισσότερη ανάλυση είναι απαραίτητη για να αποδειχθεί αυτή η υπόθεση. Προκειμένου να αντληθούν επιπρόσθετα στοιχεία για τη ρύθμιση της δράσης του Erf, διερευνήθηκε η αλληλεπίδρασή του με τους συγκαταστολείς Hipk1 και Ring1Β. Οι δυο παραπάνω πρωτεϊνες είχαν ανιχνευθεί ως αλληλεπιδρώσες, με τον Erf, πρωτεϊνες σε σάρωση με το σύστημα των δύο υβριδίων στο σακχαρομύκητα. Η αλληλεπίδραση του Erf με την Ring1B δεν επιβεβαιώθηκε σε κύτταρα θηλαστικών. Αντίθετα, ο Erf wt, αλλά και ο Erf M1-7, αλληλεπιδρούν με την κινάση-συγκαταστολέα Hipk1, καθώς και με ένα κυρίαρχα αρνητικό της μετάλλαγμα (Hipk1KR, ελαττωματικό για την ενεργότητα κινάσης). Χαρτογράφηση της περιοχής αλληλεπίδρασης έδειξε ότι το αμινοτελικό τμήμα του Erf και συγκεκριμένα το τμήμα 100-202αα είναι υπεύθυνο για την πρόσδεση στην Hipk1. Επιπλέον, η Hipk1 και η Hipk2 φωσφωρυλιώνουν το αμινοτελικό άκρο του Erf in vitro, όχι όμως και την κεντρική και καρβοξυτελική του περιοχή, σε συνέπεια με τα δεδομένα από τα πειράματα αλληλεπίδρασης. Ωστόσο, δεν είναι γνωστό ποια κατάλοιπα φωσφωρυλιώνονται. Σε δοκιμασίες λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας είτε ετερόλογους GAL4-καθοδηγούμενους SV40 υποκινητές αναφοράς, είτε το c-Myc υποκινητή φάνηκε ότι η Hipk1 και η Hipk2 αναιρούν την κατασταλτική δράση του Εrf. Πρέπει να τονιστεί ότι οι Hipk1KR και Hipk2KR πρωτεϊνες δεν έχει καμία επίδραση στην Erf-διαμεσολαβούμενη μεταγραφική καταστολή. Πειράματα υποκυτταρικού εντοπισμού της GFP-ERF συντηγμένης πρωτεΐνης παρουσία των Hipk1/2, έδειξαν ότι ο Erf μετατοπίζεται μερικώς στο κυτταρόπλασμα, εξηγώντας έτσι την αρνητική επίδραση της στη δράση του Erf, ενώ παρουσία των Hipk1/2KR ο υποκυτταρικός εντοπισμός του Erf δεν επηρεάζεται. Τέλος, μελετήθηκε η ειδικότητα της αλληλεπίδραση Erf-Erk in vivo. Τμήματα της κεντρική περιοχής του Erf υπερέκφράστηκαν και η σηματοδότηση του Ras/Erk μονοπατιού εξετάστηκε με βάση την υποκυτταρική κατανομή της GFP-ERF υβριδικής πρωτεΐνης. Έτσι το τμήμα 294-425 αναστέλλει αποτελεσματικά το Ras/Erk σηματοδοτικό μονοπάτι, χωρίς να επηρεάζει την ενεργότητα της Erk κινάσης. Η αλλαγή στην υποκυτταρική κατανομή του Erf οφείλεται στη μειωμένη φωσφωρυλίωσή του, όπως φαίνεται από ανοσοφθορισμό με ειδικό αντίσωμα που αναγνωρίζει τη φωσφωρυλιωμένη του μορφή. Επιπλέον, ο Elk-1 μεταγραφικός παράγοντας καθώς και η κινάση Rsk2 (που αποτελούν υποστρώματα της Erk κινάσης) απενεργοποιούνται παρουσία του τμήματος 294-425 του Erf. Τα παραπάνω υποστηρίζουν την άποψη ότι ο Erf αποτελεί ειδικό υπόστρωμα της Erk κινάσης και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ειδικός αναστολέας του μονοπατιού Ras/Erk.