Μελέτη του βιολογικού ρόλου του ERF μέσω της στοχευμένης απενεργοποίησης του γονιδίου στον ποντικό

Abstract

The ETS family of transcription factors are characterized by an evolutionarily conserved DNA- binding domain, the ETS domain, of about 85 amino acid recidues that forms a winged helix-tum-helix structural motif. The family of ETS proteins includes transcriptional activators or repressors that their transcriptional activity is regulated by RAS/MAPK signaling pathway. ETS family members control important biological processes, including cell proliferation, differentiation, apoptosis,hematopoiesis, angiogenesis and oncogenesis by recognizing and binding due to the ETS domain to consensus sequences with the characteristic motif GGAA/T in the promoters and enhancers oftheir target genes. ERF is an ETS- domain protein with strong transcriptional repressor activity thatrepresses transcription through a distinct C- terminus located repressor domain. The 2.8 kb Erf mRNA encodes for an 80 kDa phospho- protein that is ubiquitously expressed in the developing mouse embryo and adult tissues as well as in all cell lines tested. ERF is an effector of the RAS/MAPK signaling pathway that is regulated through direct ERK phosphorylation. ERF- ERK interaction results in the phosphorylation of multiple serine and threonine residues within the nucleus. This phosphorylation determines its subcellular localization and thus its function as atranscriptional repressor. After mitogenic stimulation ERF is phosphorylated by Erk and exported from the nucleus to the cytoplasm, while in the absence of mitogenic stimulation ERF is unphosphorylated in the nucleus. Phosphorylation deficient ERF mutants are primarily nuclear and can arrest cell cycle at the G0/G1 phase. These data suggest that ERF may regulate genes that are activated during G1 phase. Also it has been suggested that the ERF mediated cell cycle arrest is Rb dependent. ERF can also act as a tumor suppressor since it has been shown that can suppress ets- and rasinduced tumorigenicity as well as Ewing’s sarcoma in cellular systems. In order to study the Erf function we generated Erf-/- mice through gene targeting in ES cells. Erf loss of function results in embryonic lethality at 10.5dpc due to placenta defects. Erf is expressed in extra embryonic tissues like the yolk sac endoderm and the allantois. During placenta development, Erf is expressed in the trophoblast stem cells of the extraembryonic ectoderm and in later stages in the chorion diploid cells and the labyrinthine trophoblasts. Erf -/- placentas exhibit compact chorion layer, absence of labyrinth, expanded giant cell layer and diminished spongiotrophoblast layer. Marker analysis for different cell types of the trophoblast lineage by in situ hybridization, indicated that Erf -/- placentas lack post- mitotic chorion cells as well as the terminal differentiated labyrinthine cell type, the syncytiotrophoblasts, while they show prolonged expression of trophoblast stem cell(TSC) markers, like Errò. These data suggest that loss of Erf may block terminal differentiation ofthe chorion diploid cells, revealing a new role for ETS genes in TSC differentiation. In addition, while we can see organogenesis of allantois in Erf-/- embryos, there is a delay in its growth and its proximity to the chorion. In normal placentas we have chorioallantoic fusion at 8.5dpc, while in Erf-/- placentas we can see contact between few allantois mésothélial cells and chorion cells. Finally, Erf-/- embryos have defects in the angiogenesis in areas of the head as well as in the yolk sac. While Erf-/- yolk sacs develop the primary capillary plexus, it does not further organized to the highly branched network seen in the wt yolk sacs. Thus it is conceivable that Erf may alsoparticipate in later developmental stages during angiogenesis.

Η οικογένεια των ETS μεταγραφικών παραγόντων χαρακτηρίζεται από μία εξελικτικά συντηρημένη περιοχή πρόσδεσης στο DNA, το ETS domain, το οποίο αποτελείται από περίπου 85 αμινοξέα και σχηματίζει τη χαρακτηριστική δομή winged helix-tum-helix. Η οικογένεια των ETS πρωτεϊνών περιλαμβάνει μεταγραφικούς ενεργοποιητές ή καταστολείς των οποίων η μεταγραφική ενεργότητα ρυθμίζεται από το RAS/MAPK σηματοδοτικό μονοπάτι. Τα μέλη της οικογένειας των ETS μεταγραφικών παραγόντων ελέγχουν σημαντικές βιολογικές διαδικασίες, όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση, την αιμοποίηση, την αγγειογένεση και την ογκογένεση με το να αναγνωρίζουν και να προσδένονται μέσω του ETS domain σε συναινετικές (consensus) αλληλουχίες με το χαρακτηριστικό μοτίβο GGAA/T, στους υποκινητές και τους ενισχυτές των γονιδίων-στόχων τους. To ERF, είναι ένας ισχυρός μεταγραφικός καταστολέας της οικογένειας των ETS πρωτεϊνών το οποίο καταστέλλει τη μεταγραφή μέσω μιας διακριτής περιοχής στο Cτελικό του άκρο που ονομάζεται repressor domain. To 2.8 kb mRNA του Erfτο οποίο κωδικοποιεί μία φωσφοπρωτεΐνη 80 kDa, εκφράζεται παντού στο αναπτυσσόμενο έμβρυο και σε όλους τους ιστούς στο ενήλικο και τις κυτταρικές σειρές που έχουν εξεταστεί. To ERF ρυθμίζεται από το σηματοδοτικό μονοπάτι RTK/RAS/ERK και συγκεκριμένα με φωσφορυλίωση από την ERK. Η αλληλεπίδραση του ERF με την ERK οδηγεί στη φωσφορυλίωσή του σε πολλαπλές θέσεις θρεονίνης και σερίνης μέσα στον πυρήνα. Η φωσφορυλίωση καθορίζει την υποκυτταρική του εντόπιση καισυνεπώς τη λειτουργία του ως μεταγραφικός καταστολέας. Μετά από ενεργοποίηση με μιτογόνα ερεθίσματα το ERF φωσφορυλιώνεται από την ERK και εξέρχεται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, ενώ απουσία μιτογόνων ερεθισμάτων το ERF βρίσκεται στον πυρήνα μη φωσφορυλιωμένο. Μεταλλαγμένες μορφές του ERF είναι κατεξοχήν πυρηνικές και έχουν ως αποτέλεσμα να σταματάνε τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G0/GE Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι το ERF μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων που ενεργοποιούνται κατά την είσοδο στη Gl φάση του κυτταρικού κύκλου. Επίσης έχει βρεθεί ότι το ERF μπορεί να επηρρεάσει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου κατά ένα Rb-εξαρτώμενο τρόπο. Ακόμη το ERF θα μπορούσε να αποτελεί έναν ογκοκαταστολέα αφού έχει βρεθεί ότι αναστέλλει τον ets και ras επαγώμενο μετασχηματισμό καθώς και το σάρκωμα του Ewing’s σε κυτταρικά συστήματα. Με σκοπό να μελετήσουμε το βιολογικό ρόλο του Erf δημιουργήσαμε ομόζυγα μεταλλαγμένα ποντίκια για το γονίδιο του Erf Erf -/-, με τη διαδικασία της γονιδιακής στόχευσης με ομόλογο ανασυνδυασμό στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Η διακοπή της λειτουργίας του Erf προκαλεί εμβρυϊκή θνησιμότητα στο στάδιο 10.5dpc εξαιτίας σοβαρών προβλημάτων στην ανάπτυξη του πλακούντα. To Erfεκφράζεται σε εξωεμβρυϊκούς ιστούς, όπως στο ενδόδερμα του λεκιθικού σάκου και στην αλλαντοΐδα. Στον αναπυσσόμενο πλακούντα, εκφράζεται από τα αρχέγονα τροφοβλαστικά κύτταρα του εξωεμβρυϊκού εκτοδέρματος κατά τη γαστριδίωση, ενώ σε αργότερα στάδια εκφράζεται από τα διπλοειδή κύτταρα του χορίου και τα τροφοβλαστικά κύτταρα του λαβυρίνθου. Στους πλακούντες των Erf -/- εμβρύων παρατηρείται μία συμπαγής στοιβάδα του χορίου, αγενεσία του λαβυρίνθου, μία εκτεταμένη στοιβάδα γιγαντιαίων κυττάρων και μία μικρότερη σε μέγεθος σπογγώδης στοιβάδα. Η ανάλυση γονιδίων- δεικτών για τους διάφορους υποκυτταρικούς τύπους της τροφοβλαστικής γενεαλογίας, με in situ υβριδοποίηση, έδειξε ότι από τους μεταλλαγμένους πλακούντες απουσιάζουν τα μεταμιτωτικά κύτταρα της στοιβάδας του χορίου καθώς και ο τελικά διαφοροποιημένος κυτταρικός τύπος της στοιβάδας του λαβυρίνθου, τα συγκυτιοκύτταρα, ενώ παρατηρείται μιαπαρατεταμένη έκφραση γονιδίων χαρακτηριστικών για τα αρχέγονα τροφοβλαστικά κύτταρα (TSCs), όπως του Errò. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η έλλειψη του Erf πιθανόν να αναστέλλει την τελική διαφοροποίηση των διπλοειδών κυττάρων του χορίου σε συγκυτιοκύτταρα αποκαλύπτοντας έναν νέο ρόλο των ETS μεταγραφικών παραγόντων στη διαφοροποίηση της τροφοβλαστικής γενεαλογίας. Επιπλέον, αν και στους Erf-/- πλακούντες πραγματοποιείται η οργανογέννεση τηςαλλαντοΐδας, από την άλλη παρατηρείται καθυστέρηση τόσο στην ανάπτυξή της όσο και στη γειτνίασή της με το χόριο. Ενώ στους φυσιολογικούς πλακούντες η χοριοαλλαντοϊδική σύντηξη ολοκληρώνεται στο στάδιο 8.5dpc, στους μεταλλαγμένους πλακούντες παρατηρείται επαφή ανάμεσα σε λίγα μεσοθηλιακά κύτταρα της αλλαντοΐδας και του χορίου, υποδηλώνοντας ότι το Erf πιθανόν ναπαίζει κάποιο ρόλο στους μηχανισμούς που μεσολαβούν κατά τη χοριοαλλαντοϊδική σύντηξη.Τέλος τα Erf-/- έμβρυα παρουσιάζουν πρόβλημα στην αγγειογένεση στην περιοχή του κεφαλιού καθώς και στους λεκιθικούς σάκους. Αν και στους λεκιθικούς σάκους των μεταλλαγμένων εμβρύων σχηματίζεται το πρωτογενές αγγειακό δίκτυο των τριχοειδών στη συνέχεια τα αγγεία δεν ανασυνδυάζονται και δε διακλαδίζονται ώστε να δημιουργηθεί ένα πολύπλοκο αγγειακό δίκτυο. Συνεπώς το Erf πιθανόν να συμμετέχει και στις αναπτυξιακές διαδικασίες που συντελούνται σε αργότερα στάδια κατά την δημιουργία ενός πολύπλοκου αγγειακού συστήματος.