Ανάπτυξη μεθόδου προσδιορισμού θρομβίνης και μελέτη του μηχανισμού πήξης του αίματος

Abstract

Blood coagulation mechanism consists of sequential reactions leading to the reaction where prothrombin is transformed into thrombin. Factor VIIa has culminant position in this mechanism, given its ability to activate both factor IX and X. It is well known today that in vivo coagulation is triggered after the release of tissue factor and the subsequent formation of complex FVIIa-TF. The present work was mainly focused to thrombin generation via the study of the aforementioned reaction. We studied the mechanism of coagulation, and, more particularly, the mechanism of action of FVIIa in excess. We developed initially an original specific method (with the aid of Western Blotting); this method allowed monitoring of the kinetics of thrombin generation.One of the main advantages of the method is that thrombin generation can be monitored in a variety of biological samples directly. After all necessary optimization studies, the follow studies have been carried out. 1/ Application via monitoring of thrombin generation in samples depleted of different factors. The results obtained showed that the method developed responded correctly to different coagulation disorders. 2/ Coagulation mechanism in various coagulation pathological conditions. Various human blood or plasma samples had been used from normal donors, patients with hemophilia A (lack of factor VIII), thrombocytopenia (lack of platelets), leukemia (lack of functional platelets), as well as life threatening haemorrhage. In all cases thrombin generation was studied and compared to the one of normal samples. 3/ The mechanism of action of FVIIa in excess. We wanted to investigate whether FVIIa acts via the classical scheme of “intrinsic” and “extrinsic” pathways. We investigated the effect of platelets, tissue factor, coagulation inhibitors etc. In every case we studied the effect of the addition (or administration) of FVIIa was an early thrombin generation. According to the case, platelets or tissue factor enhance the action of FVIIa. In a complete system of coagulation FVIIa, in the presence of TF, most probably activates both FX and FIX, thus allowing “time saving” by circumventing part of either exogenous or intrinsic pathway. When, FIX is lacking, in the presence of TF, the only remaining possibility for FVIIa is to produce FXa, which probably, after a certain concentration level, bypasses the high concentrations of inhibitors known to be present in these systems; the produced FXa migrates on platelets surface and acts on prothrombin; in the absence of TF, high amounts of FVIIa probably go towards to activated platelets, where, despite the absence of appropriate receptors, FVIIa may activate directly FX thus leading to thrombin generation.

Ο μηχανισμός της πήξης περιλαμβάνει μια σειρά αλληλοδιάδοχων πρωτεολυτικών αντιδράσεων που οδηγούν στην τελική αντίδραση της μετατροπής της προθρομβίνης σε θρομβίνη. O παράγοντας VIIa κατέχει ιδιαίτερη θέση στο σύνολο του μηχανισμού δεδομένου ότι μπορεί να ενεργοποιήσει και τον παράγοντα X και τον παράγοντα IX. Σήμερα άλλωστε είναι γενικώς αποδεκτό ότι ο πήξη αρχίζει in vivo όταν εκλυθεί ο ιστικός παράγοντας (TF) και δημιουργηθεί το σύμπλοκο FVIIa-TF. Η παρούσα εργασία εστιάστηκε περισσότερο στην αντίδραση της δημιουργίας θρομβίνης μέσα από την οποία μελετήθηκε ο μηχανισμός της πήξης και έγινε μια προσπάθεια διασαφήνισης του τρόπου δράσης της περίσσειας του παράγοντα VIIa. Αρχικά, αναπτύχθηκε μια μέθοδος (με τη βοήθεια του Western Blotting) η οποία έδωσε τη δυνατότητα της (οπτικής) παρακολούθησης της κινητικής μετατροπής της προθρομβίνης σε θρομβίνη. Ένα από τα κύρια πλεονεκτήματα της μεθόδου που αναπτύχθηκε είναι ότι κατέστη δυνατό για πρώτη φορά να γίνει παρακολούθηση της κινητικής παραγωγής θρομβίνης σε μια πλειάδα βιολογικών δειγμάτων. Μετά τη βελτιστοποίηση της συγκεκριμένης μεθόδου μελετήθηκαν 1ον εφαρμογές μέσω της παρακολούθησης της κινητικής παραγωγής θρομβίνης σε δείγματα με έλλειψη συγκεκριμένων παραγόντων. Τα αποτελέσματα των συγκεκριμένων πειραμάτων συνέβαλαν στον έλεγχο της μεθόδου και έδειξαν ότι ανταποκρίνεται ικανοποιητικά στις διάφορες διαταραχές της πήξης. 2ον ο μηχανισμός της πήξης σε παθολογικές περιπτώσεις. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δείγματα ανθρώπινου ολικού αίματος ή πλάσματος, από φυσιολογικούς δότες, ασθενείς με αιμορροφιλία τύπου Α (έλλειψη παράγοντα VIII), θρομβοπενία (έλλειψη αιμοπεταλίων), λευχαιμία (έλλειψη λειτουργικών αιμοπεταλίων) και με αιμορραγίες επικίνδυνες για την επιβίωση. Σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις μελετήθηκε η επίπτωση της έλλειψης κάποιου παράγοντα, ανάλογα με την παθολογία, στην κινητική μετατροπή της δημιουργίας θρομβίνης σε σύγκριση με αυτή του φυσιολογικού δείγματος. 3ον ο μηχανισμός δράσης της περίσσειας του παράγοντα VIIa. Σε όλα τα παραπάνω δείγματα μελετήθηκε η επίπτωση της προσθήκης της περίσσειας του παράγοντα VIIa καθώς και ο μηχανισμός δράσης του αν δηλαδή γίνεται μέσω του ονομαζόμενου ?ενδογενούς δρόμου? ή του ?εξωγενούς? διαμέσου της μελέτης της συμμετοχής των αιμοπεταλίων, πηγών ιστικού παράγοντα (θρομβοπλαστίνη, μονοκύτταρα), αναστολέων της πήξης κτλ. Σε κάθε περίπτωση το αποτέλεσμα της προσθήκης της περίσσειας του παράγοντα VIIa ήταν η επιτάχυνση της εμφάνισης θρομβίνης. Η παρουσία είτε αιμοπεταλίων είτε ιστικού παράγοντα συμβάλλει στην δράση του παράγοντα VIIa με έναν μηχανισμό που ερμηνεύεται ανάλογα με την περίπτωση. Φαίνεται λοιπόν, ότι ρόλος της περίσσειας του FVIIa είναι πολλαπλός. Σε ένα πλήρες σύστημα παρουσία ιστικού παράγοντα πιθανά να ενεργοποιεί τόσο τον FX όσο και τον FIX και να επιτυγχάνεται έτσι χρονικό κέρδος μέσω παράκαμψης μέρους του εξωγενούς και ενδογενούς δρόμου. Σε περίπτωση έλλειψης του παράγοντα ΙΧ, παρουσία ιστικού παράγοντα, η μοναδική διέξοδος της περίσσειας του FVIIa είναι η μαζική παραγωγή FXa που ίσως από ένα σημείο και μετά να παρακάμπτει την ύπαρξη αναστολέων και να μπορεί να μεταφέρεται στο αιμοπετάλιο και να ενεργοποιεί την προθρομβίνη, ενώ σε περίπτωση απουσίας και ιστικού παράγοντα οι υψηλές διαθέσιμες συγκεντρώσεις FVIIa οδεύουν προς το ενεργοποιημένο αιμοπετάλιο όπου παρά την απουσία αντίστοιχων υποδοχέων ο FVIIa μπορεί να ενεργοποιήσει τον παράγοντα Χ ο οποίος δεσμεύεται με τον πρωτεϊνικό συμπαράγοντα Va και δρουν στην προθρομβίνη που είναι καθηλωμένη στη μεμβράνη του αιμοπεταλίου.