Μελέτη βιολογικών ιδιοτήτων σε εκχυλίσματα και φυτικές πολυφαινόλες από ελληνικές ποικιλίες αμπέλου (vitis vinifera)

Abstract

In the present study, extracts (methanolic and water) and fractions enriched in polyphenols from two Greek grape varieties, Mandilaria Santorini (red grapes) and Assyrtiko Santorini (white grapes), as well as monomeric plant polyphenols present in them were tested for their biological activity. The tested plant polyphenols were: three hydroxycinnamic acids (cafeic acid, ferulic acid and coumaric acid), two hydroxybenzoic acids (gallic acid and protocatechuic acid), four flavonoids (quercetin, rutin, (+)-catechin and (-)-epicatechin) and trans-resveratrol. The following biological properties were investigated: 1) The antioxidant activity by using the DPPH method. 2) The effect of the tested compounds on mutagenicity induced by oxidative factors. In this case, the following methods were used: i) DNA strand breakages induced by mitomycin C in plasmid DNA, ii) mutations induced by bleomycin and hydrogen peroxide in bacterial cells (Salmonella typhimurium TA102) and iii) SCEs induced by mitomycin C in cultures of human lymphocytes. 3) The effect of tested compounds on ozone-induced oxidation of SP-A protein (which is one of the major proteins of lung surfactant). 4) The effect of tested compounds on the activity of topoisomerase I enzyme. The results from the DPPH method showed the following: i) The extracts and the fractions exhibited strong antioxidant activity in low concentrations (IC50 values between 19-92 μg/ml). ii) Some of the polyphenol enriched fractions had less antioxidant activity than their corresponding extracts, and so the results suggested that the antioxidant activity of extracts is not attributed only to the polyphenols but also to other compounds or to a synergistic effect between polyphenols or between polyphenols and other compounds present in extracts. iii) The potential order of the polyphenols was: gallic acid > caffeic acid = quercetin = (-)-epicatechin > (+)-catechin > rutin > protocatechuic acid > ferulic acid > trans-resveratrol > coumaric acid. Moreover, the IC50 values some of them were in concentrations which can be achieved in the human organism through the diet. The conclusions coming from the effects of the tested compounds on the mutagenic activity induced by oxidative factors were the following: i) The extracts from both grape varieties inhibited at low concentrations the bleomycin-induced mutagenicity in bacterial cells as well as the mitomycin C-induced DNA strand breakages in plasmid DNA. Furthermore, the methanolic extracts inhibited the hydrogen peroxide-induced mutagenicity in bacterial cells. Thus, the results indicated that the inhibitory activity of grape extracts against DNA mutations induced by oxidative factors may be one of the mechanisms accounting for their chemopreventive action. ii) The antimutagenic activity of extracts could not be attributed to any of the tested polyphenols, since the concentrations of those polyphenols exerted antimutagenic activity were much lower than the concentrations of the polyphenols in the extracts. Consequently, the inhibitory activity of extracts may not be attributed to the polyphenols or there may be a synergistic activity between polyphenols or between the polyphenols and some other compounds of the extracts. iii) From the tested polyphenols, caffeic acid inhibited the bleomycin-induced mutagenicity in bacterial cells and quercetin inhibited the hydrogen peroxide-induced mutagenicity in bacterial cells as well as the mitomycin C-induced SCEs in human lymphocytes. The inhibitory activity of these polyphenols could probably be attributed not only to their strong antioxidant properties but also to their metal chelating properties. The results from the effects of the tested compounds on topoisomerase I activity showed the following: i) The extracts from both grape varieties inhibited the catalytic activity of both topoisomerase I from wheat germ and human topoisomerase I. Therefore, the inhibition of this enzyme may be one of the mechanisms accounting for the anticarcinogenic activity of grape extracts observed in other studies. ii) Some of the polyphenol enriched fractions were less potent than their corresponding extracts. Thus, the inhibitory activity of extracts against topoisomerase I may be due not only to the polyphenols but also to other compounds present in extracts. iii) From the tested polyphenols, caffeic acid, quercetin and protocatechuic acid exerted inhibition against the activity of topoisomerase I. The conclusions resulting from the effects of the tested compounds on ozone-induced oxidation of SP-A were the following: i) The flavonoids, (+)-catechin, (-)-epicatechin and rutin, inhibited in a dose-dependent manner the SP-A oxidation.lungs.

Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκε η βιολογική δράση εκχυλισμάτων (μεθανολικών και υδατικών) και πολυφαινολικών κλασμάτων από δύο ελληνικές ποικιλίες αμπέλου, Μανδηλαριά Σαντορίνης (κόκκινα σταφύλια) και Ασσύρτικο Σαντορίνης (άσπρα σταφύλια), καθώς και μονομερών φυτικών πολυφαινολών που ανιχνεύτηκαν σε αυτά. Οι φυτικές πολυφαινόλες που εξετάστηκαν ήταν: τρία υδροξυκινναμικά οξέα (καφεϊκό οξύ, φερουλικό οξύ και κουμαρικό οξύ), δύο υδροξυβενζοϊκά οξέα (γαλλικό οξύ και πρωτοκατεχοϊκό οξύ), τέσσερα φλαβονοειδή (κερκετίνη, ρουτίνη, (+)-κατεχίνη, (-)-επικατεχίνη) και η trans-ρεσβερατρόλη. Μελετήθηκαν οι εξής βιολογικές ιδιότητες: 1) H αντιοξειδωτική δράση των εξεταζόμενων ουσιών με τη μέθοδο του DPPH). 2) H επίδραση των εξεταζόμενων ουσιών σε μεταλλάξεις που προκαλούνται στο DNA από οξειδωτικούς παράγοντες. Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιήθηκαν οι εξής μέθοδοι: α) επαγωγή θραύσεων σε πλασμιδιακό DNA από τον οξειδωτικό παράγοντα μιτομυκίνη C, β) πρόκληση μεταλλάξεων σε βακτηριακά κύτταρα (S. typhimurium TA102) από τις μεταλλαξιγόνες ουσίες μπλεομυκίνη και Η2Ο2 και γ) αύξηση των SCEs από τη μεταλλαξιγόνο ουσία μιτομυκίνη C σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων. 3) H επίδραση των εξεταζόμενων ουσιών στην προκαλούμενη από το όζον οξείδωση της πρωτεΐνης SP-A του επιφανειοδραστικού παράγοντα του πνεύμονα. 4) H επίδραση των εξεταζόμενων ουσιών στη δράση του ενζύμου τοποϊσομεράση Ι. Τα αποτελέσματα από τη μέθοδο του DPPH έδειξαν τα εξής: i) Τα εκχυλίσματα και τα κλάσματα παρουσίασαν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση σε μικρές συγκεντρώσεις (τιμές του IC50 19-92 μg/ml). ii) Oρισμένα πολυφαινολικά κλάσματα είχαν μικρότερη αντιοξειδωτική δράση από τα εκχυλίσματα από τα οποία προήλθαν, άρα η αντιοξειδωτική δράση των εκχυλισμάτων δεν οφείλεται μόνο στις πολυφαινόλες που περιέχουν τα εκχυλίσματα, αλλά και σε άλλες ουσίες ή σε μια συνεργική δράση των πολυφαινολών μεταξύ τους καθώς και με άλλες ουσίες των εκχυλισμάτων. iii) H σειρά δραστικότητάς των φυτικών πολυφαινολών ήταν γαλλικό οξύ > καφεϊκό οξύ = κερκετίνη = (-)-επικατεχίνη > (+)-κατεχίνη > ρουτίνη > πρωτοκατεχοϊκό οξύ > φερουλικό οξύ > trans-ρεσβερατρόλη > κουμαρικό οξύ και οι τιμές IC50 ορισμένων από αυτές (του καφεϊκού οξέος, του γαλλικού οξέος, της (-)-επικατεχίνης και της κερκετίνης) ήταν σε συγκεντρώσεις που μπορούν να επιτευχθούν στους οργανισμούς μέσω της δίαιτας. Τα συμπεράσματα που προέκυψαν από την επίδραση των εξεταζόμενων ουσιών στη μεταλλαξιγόνο δράση οξειδωτικών παραγόντων είναι τα εξής: i) Tα εκχυλίσματα και των δύο ποικιλιών αμπέλου ανέστειλαν σε μικρές συγκεντρώσεις τη μεταλλαξιγόνο δράση της μπλεομυκίνης στα βακτηριακά κύτταρα καθώς και τις επαγόμενες από τη μιτομυκίνη C θραύσεις του πλασμιδιακού DNA, ενώ επίσης τα μεθανολικά εκχυλίσματα ανέστειλαν την προκαλούμενη από το Η2Ο2 μεταλλαξιγένεση στα βακτηριακά κύτταρα. Συνεπώς, η ανασταλτική δράση των εκχυλισμάτων αμπέλου έναντι των βλαβών που προκαλούνται στο DNA από οξειδωτικούς παράγοντες ίσως να είναι ένας από τους μηχανισμούς στους οποίους οφείλεται η χημειοπροστατευτική τους δράση. ii) H αντιμεταλλαξιγόνος δράση των εκχυλισμάτων δεν θα μπορούσε να αποδοθεί σε καμία από τις εξεταζόμενες πολυφαινόλες, γιατί οι συγκεντρώσεις των πολυφαινολών εκείνων που έδειξαν ανασταλτική δράση ήταν πολύ μικρότερες από τις συγκεντρώσεις των πολυφαινολών στα εκχυλίσματα. Άρα η ανασταλτική δράση των εκχυλισμάτων, ή δεν οφείλεται στις πολυφαινόλες ή υπάρχει μία συνεργική δράση μεταξύ των πολυφαινολών ή μεταξύ των πολυφαινολών και άλλων ουσιών των εκχυλισμάτων. iii) Από τις πολυφαινόλες, ανασταλτική δράση παρουσίασαν το καφεϊκό οξύ έναντι της επαγόμενης από μπλεομυκίνη μεταλλαξιγένεσης στα βακτηριακά κύτταρα και η κερκετίνη έναντι της επαγόμενης από Η2Ο2 μεταλλαξιγένεσης στα βακτηριακά κύτταρα αλλά και έναντι της μιτομυκίνης C στη μέθοδο με τις SCEs. H ανασταλτική δράση αυτών των πολυφαινολών οφείλεται πιθανώς στο ότι διαθέτουν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση αλλά παράλληλα και ισχυρές χηλικές ιδιότητες. Η μελέτη της επίδρασης των εξεταζόμενων ουσιών στη δράση της τοποϊσομεράσης Ι έδειξε τα εξής: i) Τα εκχυλίσματα και από τις δύο ποικιλίες ανέστειλαν τη δράση της ανθρώπινης τοποϊσομεράσης Ι καθώς και αυτής από σπέρμα σιταριού, άρα η αναστολή αυτού του ενζύμου είναι ίσως ένας από τους μηχανισμούς στους οποίους οφείλεται η αντικαρκινική δράση εκχυλισμάτων από σταφύλια που έχει παρατηρηθεί σε άλλες μελέτες.