Μελέτη της προσαρμογής ενζύμων σε χαμηλές θερμοκρασίες: βιοχημική μελέτη δύο χιτινασών από το ψυχρόφιλο βακτήριο Arthrobacter sp str. TAD20

Abstract

In order to explore the effects of local flexibility on the cold adaptation of enzymes, we designed point mutations aiming to modify side chain flexibility at the active site of the psychrophilic alkaline phosphatase from the Antarctic strain TAB5. The mutations were designed based on multiple sequence alignment, assisted by a homology based model. The mutagenesis targets were residues Trp-260 and Ala-219 of the catalytic site and His-135 of the Mg2+ binding site. The replacement of Trp-260 by Lys in mutant W260K, resulted in a less active than the wild-type enzyme in the temperature range 5-25°C. The additional replacement of Ala-219 by Asn in the double mutant W260K/A219N, resulted in a drastic increase in the energy of activation which is reflected in a considerably decreased activity at temperatures 5- 15°C and a significantly increased activity at 20-25°C. Further substitution of His135 by Asp in the triple mutant W260K/A219N/H135D restored the low energy ofactivation. In addition, the His135 to Asp replacement in mutants H135D andW260K/A219N/H135D resulted in a considerable stabilization. Furthermore, we designed point mutations aiming to alter the distribution of glycine residues close to the active site of the psychrophilic alkaline phosphatase. The mutagenesis targets were residues Gly-261 and Gly-262. The replacement of Gly-262 by Ala resulted in an inactive enzyme. Substitution of Gly-261 by Ala resulted in an enzyme with lower stability and increased energy of activation. The double mutant G261A/Y269A designed on the basis of side-chain packing criteria from a modeled structure of the enzyme resulted in restoration of the energy of activation to the levels of the native enzyme and in an increased stability compared to the mutant G261A. It seems therefore, that the Gly cluster in combination with its structural environment plays a significant role in the cold adaptation of the enzyme. These results suggest that the psychrophilic character of mutants can be established or masked by very slight variations of the wild-type sequence, which may affect active site flexibility through changes in various conformational constraints. The gene encoding chitinase ArChiB from the Antarctic bacterium Arthrobacter sp. TAD20 has been expressed in E. coli and the recombinant enzyme purified to homogeneity. In our effort to engineer cold adapted biocatalysts through rational redesign to operate at elevated temperatures, we performed mutations aiming to increase the rigidity of the molecular edifice of the selected psychrophilic chitinase at remote from the active site positions. The mutations were designed based on multiple sequence alignment, assisted by a homology based model, and included restoration of a salt bridge and replacement of selected Gly residues by either Pro or Gln. Restoration of a salt bridge in mutant N198K resulted to a more stable protein (ΔTm=0.6°C). The mutant G93P exhibits a ΔTm of 1.2°C while mutants G254P, G406Q exhibited decreased stability, indicating that the effect of mutating Gly residues on enzyme stability is rather complex and can be only seen in combination with their structural environment. Further mutations aiming to eliminate a unique in this enzyme loop, and restore a disulfide bond did not produce an active enzyme. Kinetic and spectroscopic analysis of these enzyme variants revealed that the kinetic parameters kcat and Km have been significantly modified. The mode of action of ArChiA and ArChiB from the Antarctic Arthrobacter sp. Strain TAD20 on both N-acetylchitooligomers and chitin polymers was examined using HPLC. ArChiB resulted to be an exochitinase cleaving N, N’-diacetylchitobiose from the non-reducing end while ArChiA an endochitinase cleaving chitin substrates randomly. At 100 μg/ml concentration ArChiB inhibited spore germination and hyphal elongation of the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea strain 309 by 15% and 30% respectively. With ArChiA the effect was more pronounced. At enzyme concentration of 100 μg/ml and 200 μg/ml a 70% and 90% inhibition of conidial germination was observed as well as a 60% and 90% inhibition of germination tube elongation respectively. The combination of both enzymes at concentrations of 100 μg/ml produced a 76% and 53.8% inhibition of conidial germination and hyphal elongation respectively.

Στην προσπάθεια μας να μελετήσουμε την επίδραση της τοπικής ευκαμψίας στην προσαρμογή των ενζύμων σε χαμηλές θερμοκρασίες σχεδιάσαμε σημειακές μεταλλάξεις με στόχο την μεταβολή της ευκαμψίας των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων στο ενεργό κέντρο της αλκαλικής φωσφατάσης από το στέλεχος TAB5. Οι μεταλλάξεις βασίστηκαν σε πολλαπλές στοιχίσεις αλληλουχιών και την βοήθεια μοντέλου της τρισδιάστατης δομής. Οι μεταλλάξεις έγιναν στα κατάλοιπα Trp-260 και Ala-219 του καταλυτικού κέντρου και His-135 του σημείου πρόσδεσης του ιόντος Mg2+. Η αντικατάσταση της Trp-260 από Lys στη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη W260K οδήγησε σε ένα λιγότερο ενεργό, συγκριτικά με το φυσικό ένζυμο, στο εύρος θερμοκρασιών 5-25°C. Η συμπληρωματική αντικατάσταση της Ala-219 από Asn στο διπλά μεταλλαγμένο ένζυμο W260K/A219N, οδηγεί σε δραστική αύξηση της ενέργειας ενεργοποίησης που αντικατοπτρίζεται στην μειωμένη ενεργότητα σε θερμοκρασίες 5-15°C και μια σημαντική αύξηση της ενεργότητας στους 20-25°C. Περεταίρω αντικατάσταση της His135 από Asp στο τριπλά μεταλλαγμένο ένζυμο W260K/A219N/H135D αποκαθιστά την χαμηλή ενέργεια ενεργοποίησης. Επιπλέον, η αντικατάσταση της His135 από Asp στις μεταλλάξεις H135D και W260K/A219N/H135D οδηγεί σε σημαντική σταθεροποίηση. Σχεδιάστηκαν σημειακές μεταλλάξεις με στόχο να μεταβάλλουν την συγκέντρωση των καταλοίπων Gly κοντά στο ενεργό κέντρο της προσαρμοσμένης στη χαμηλή θερμοκρασία αλκαλικής φωσφατάσης. Οι στόχοι των μεταλλάξεων είναι τα κατάλοιπα Gly-261 και Gly-262. Η αντικατάσταση της Gly-262 από Ala οδήγησε σε ανενεργό ένζυμο. Η αντικατάσταση της Gly-261 από Ala οδήγησε στη παραγωγή ενζύμου με μικρότερη σταθερότητα και αυξημένη ενέργεια ενεργοποίησης. Το διπλά μεταλλαγμένο ένζυμο G261A/Y269A σχεδιάστηκε με κριτήριο το πακετάρισμα των πλευρικών αλυσίδων από τη δομή του μοντέλου, και οδήγησε στην επαναφορά της ενέργειας ενεργοποίησης σε επίπεδα του φυσικού ενζύμου και σε ένζυμο με αυξημένη σταθερότητα συγκρίνοντας με το ένζυμο που φέρει τη μετάλλαξη G261A. Φαίνεται λοιπόν, ότι το σύμπλεγμα Gly σε συνδυασμό με το δομικό περιβάλλον παίζει σημαντικό ρόλο στην προσαρμογή του ενζύμου στις χαμηλές θερμοκρασίες. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ο ψυχρόφιλος χαρακτήρας των μεταλλαγμένων ενζύμων μπορούν να εγκαθιδρυθούν ή να αποκρυπτούν από σημειακές αλλαγές της αλληλουχίας φυσικών ενζύμων, που μπορούν να επιδράσουν στην ευκαμψία του ενεργού κέντρου. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την χιτινάση ArChiB από το βακτήριο της Ανταρκτικής Arthrobacter sp. TAD20 εκφράστηκε σε κύτταρα E.coli και το ανασυνδυασμένο ένζυμο απομονώθηκε σε ομοιογένεια. Στην προσπάθεια μας να δημιουργήσουμε βιοκαταλύτες που λειτουργούν σε υψηλές θερμοκρασίες μεταλλάσσοντας ένζυμα προσαρμοσμένα σε χαμηλές θερμοκρασίες, σχεδιάσαμε μεταλλάξεις που είχαν στόχο να αυξήσουν την ακαμψία του μορίου του ενζύμου, σε απομακρυσμένες από το ενεργό κέντρο περιοχές. Οι μεταλλάξεις σχεδιάστηκαν βασισμένες σε στοιχίσεις αλληλουχιών και σε μοντέλο δομής του ενζύμου, και περιλαμβάνουν την επαναφορά ενός δεσμού άλατος, και την αντικατάσταση επιλεγμένων καταλοίπων Gly από Pro ή Gln. Η επαναφορά του δεσμού άλατος στη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη N198K οδήγησε σε πιο σταθερή πρωτεΐνη (ΔTm=0.6°C). Η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη G93P εμφανίζει ΔTm 1.2°C ενώ οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες G254P, G406Q εμφανίζουν μειωμένη σταθερότητα, υποδεικνύοντας ότι η επίδραση των μεταλλαγμένων καταλοίπων Gly, στη σταθερότητα, είναι πολυσύνθετο και εμφανίζεται σε συνδυασμό με το δομικό τους περιβάλλον. Μεταλλάξεις που έγιναν με στόχο να απομακρύνουν μια μοναδική σε αυτό το ένζυμο περιοχή ελεύθερης δομής, καθώς και τη δημιουργία ενός δισουλφιδικού δεσμού οδήγησαν σε ανενεργές πρωτεΐνες. Κινητικές και φωτομετρικές αναλύσεις αυτών των ενζύμων δείχνουν ότι οι κινητικές παράμετροι kcat and Km έχουν αλλάξει σημαντικά. Ο μηχανισμός δράσης των χιτινασών ArChiA και ArChiB από το βακτήριο Arthrobacter sp. strain TAD20 σε Ν-ακετυλχιτοολιγομερή και πολυμερή χιτίνης εξετάστηκε με τη χρήση HPLC. Η ArChiB αποδείχθηκε ότι είναι εξοχιτινάση που αφαιρεί Ν, Ν’-διακέτυλχιτοβιόζη από το μη ανάγων άκρο ενώ η ArChiA είναι ενδοχιτινάση που υδρολύει το υπόστρωμα χιτίνης σε τυχαίες θέσεις. Σε συγκέντρωση 100 μg/ml η ArChiB εμποδίζει την βλάστηση σπορίων και την επιμήκυνση υφών του φυτοπαθογόνου μύκητα Botrytis cinerea strain 309 κατά 15% και 30% αντίστοιχα. Με την ArChiA το φαινόμενο ήταν εντονότερο. Σε συγκεντρώσεις 100 μg/ml και 200 μg/ml η παρεμπόδιση της βλάστησης σπορίων ήταν 70% and 90% αντίστοιχα, ενώ 60% και 90% η παρεμπόδιση της επιμήκυνσης του σωλήνα αναπαραγωγής. Ο συνδυασμός των δύο ενζύμων σε συγκεντρώσεις 100 μg/ml οδήγησε σε 76% και 53.8% αναστολή της βλάστησης των σπορίων και της επιμήκυνσης των μυκητιακών υφών αντίστοιχα.