Διερεύνηση του ρόλου των cis-ρυθμιστικών στοιχείων του συμπλέγματος των β-γονιδίων της σφαιρίνης, στη μεταστροφή της αιμοσφαιρίνης με in vitro και in vivo λειτουργικές μελέτες

Abstract

The specific aims of this PhD thesis were focused on (1) the identification of the role of the elements Enh, F, O, P, S, U, M, Μ1 and Μ2, and of the synergistic role of Εnh+F and O+P in the expression of the luciferase reporter gene, by using transient transfection assays in erythroid and non-erythroid cells, (2) the identification of the role of the elements Enh and F in transgenic mice, by deleting them via homologous recombination, and (3) the identification of the role of the HPFH-2, HPFH-3 and HPFH-6 enhancers in transgenic mice. Identification of the in vitro role of elements located in the region between ᴬγ and δ genes. The role of the elements Enh and F, located downstream the ᴬγ gene, and the elements O, P, S, U, M, M1 and M2, located upstream the δ gene was identified on the expression of the luciferase gene, driven by the ᴳγ promoter and in the presence of the SV40 enhancer. The analysis took place by using transient transfection assays in erythroid (K562) and non-erythroid (HeLa) cells. The S element in the direction 5’→3’ had strong silencing effect in the luciferase gene activity in K562 and HeLa cells. The elements M, M1 and M2 had also strong silencing effect in K562 cells. The element M2 had strong silencing effect not only in K562, but also in HeLa cells. A small synergistic effect of the elements Enh+F and O+P was observed. The role of the element F was further identified on the expression of the luciferase gene driven by the ᴳγ promoter and in the absence of the SV40 enhancer. In this case very low luciferase activity was observed, proving its strong silencing effect. Deletion of the Enh and F elements by homologous recombination and identification of their role in transgenic mice. We developed an efficient homologous recombination system in E. coli DH10B cells (Imam et al., 2000) and by using this system we deleted the Enh and F elements from a PAC containing the β-globin locus. The PAC with the deletion was microinjected in fertilized mouse eggs. Three founder animals were generated and two lines were established. The expression of the human ε, γ and β genes was analysed by using S1 nuclease protection assays in the embryonic stage of day 10.5, the fetal stage of day 12.5 and 16.5 and the adult stage. In the embryonic stage the total transcriptional output of the human genes was increased that resulted in a significantly increased expression of the γ and ε genes in the lines with the deletion of the elements Enh and F (Katsantoni et al., 2001). These elements seem to be stage specific embryonic silencers and have an important role on the regulation of expression of the embryonic genes. In the fetal and the adult stage no differences were observed in comparison to the control line with the intact PAC (Katsantoni et al., 2001) and other elements acting alone or synergistically with the Enh and F might play an important role in the regulation of the γ globin genes expression, the silencing of the γ genes in the adult stage and the haemoglobin switching. To analyse further the transcription of the human genes, RΝΑ in situ hybridisations in various developmental time points were performed. The integration sites of the transgenes in the mouse genome were also mapped by using FISH. The analysis of the role of the Enh and F elements in transgenic mice and the confirmation of their silencing effect in the γ gene expression, together with the ability to delete them via homologous recombination, open new ways for the reactivation of γ genes for therapeutic purposes. Identification of the role of HPFH-2, HPFH-3 and HPFH-6 enhancers in transgenic mice. The role of the ΗPFH-2, HPFH-3 and HPFH-6 enhancers has been identified in transgenic mice. The cosmid constructs used contained the human LCR, the ᴬγ gene, the Enh and F silencers and one HPFH enhancer. The control construct contained the LCR, the ᴬγ gene and the Enh and F silencers. The initial lines generated from the microinjections were analysed in the adult stage by using S1 nuclease protection assays. A lot of the transgenic lines (most of them were multi copy) were expressing the ᴬγ gene in a higher level than the level of the control lines (Katsantoni et al., 2000, 2001). The multi copy lines were bred with cre expressing mice to generate single copy animals. In the single copy lines the expression of the ᴬγ gene was analysed in the developmental time points of fetal day 12.5 and 16.5 and in the adult stage, by using S1 nuclease protection analysis. The switching phenomenon was obvious in all the lines analysed in various developmental time points. The ᴬγ gene was silenced in the adult stage of the control lines. The HPFH2C and HPFH6A lines showed expression of the ᴬγ gene in the adult stage and higher expression in the fetal time points of day 12.5 and 16.5. The HPFH2F line showed no expression of the ᴬγ gene in the adult stage, but higher expression in the fetal time points of day 12.5 and 16.5. In order to explain the results of the S1 analysis and to correlate the role of the HPFH enhancers with their integration site in the mouse genome, FISH mapping was performed. A correlation of the higher expression of the gene and the integration far away from the centromere and the telomere, that are probably euchromatic regions, was observed. The HPFH-2 enhancer had the strongest enhancing effect. The HPFH-2 and HPFH-6 enhancers work in vivo when they are aided by positive position effects. The HPFH-3 enhancer was not working in the lines analysed, despite the integrations far away from the centromere and the telomere. In the HPFH2C and HPFH6A expressing lines we have determined the distribution of the ᴬγ gene expression between the cells and it was found to be pancellular, like in HPFH heterozygotes. The generated models of HPFH transgenic mice confirmed the hypothesis for the generation of the HPFH phenotype in the HPFH deletion syndromes via juxtaposition of enhancer elements from the 3’ end of the cluster to the vicinity of the fetal genes, because of the deletion. The HPFH-2 and HPFH-6 enhancers have the ability to express the fetal gene, even in a low level, in the adult stage, when they are aided by positive position effects. They can be used in gene therapy vectors to upregulate the transferred therapeutic gene.

Οι Ειδικοί Σκοποί της Διατριβής αυτής ήταν (1) η εκτίμηση του ρόλου των στοιχείων Enh, F, O, P, S, U, M, Μ1 και Μ2, καθώς και του συνεργιστικού ρόλου των Εnh+F και των O+P στην έκφραση του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης, με πειράματα παροδικής διαμόλυνσης ερυθροποιητικών και μη ερυθροποιητικών κυτταρικών σειρών, (2) η διερεύνηση του ρόλου των στοιχείων Εnh και F σε διαγονιδιακά ποντίκια, μέσω της αφαίρεσής τους με ομόλογο ανασυνδυασμό, και (3) η μελέτη του ρόλου των ενισχυτών που βρίσκονται καθοδικά των 3’ άκρων των HPFH-2, HPFH-3, HPFH-6 σε διαγονιδιακά ποντίκια. Διερεύνηση του in vitro ρόλου στοιχείων της περιοχής μεταξύ ᴬγ και δ γονιδίων. Μελετήθηκε ο ρόλος των στοιχείων Enh και F, τα οποία εδράζονται καθοδικά του ᴬγ γονιδίου και των στοιχείων O, P, S, U, M, M1 και M2, τα οποία εδράζονται ανοδικά του δ γονιδίου, στην επίδραση της έκφρασης του γονιδίου της λουσιφεράσης, υπό τον υποκινητή του ᴳγ γονιδίου και παρουσία του ενισχυτή SV40. Η ανάλυση έγινε με παροδικές διαμολύνσεις ερυθροποιητικών (Κ562) και μη ερυθροποιητικών κυττάρων (HeLa). Το στοιχείο S, σε κατεύθυνση 5’→3’ βρέθηκε να έχει έντονη αποσιωπητική δράση σε κύτταρα K562 και HeLa. Στα κύτταρα K562 τα στοιχεία M, M1 και M2 είχαν επίσης έντονη αποσιωπητική δράση. Tο στοιχείο Μ2 παρουσίασε πολύ έντονη αποσιωπητική δράση και στα κύτταρα HeLa. Μελετήθηκε επίσης ο συνεργιστικός ρόλος των στοιχείων Enh+F και O+P και παρατηρήθηκε μικρή μόνο περαιτέρω μείωση στην έκφραση του γονιδίου της λουσιφεράσης παρουσία των κατασκευών που περιείχαν τα ζευγάρια των αποσιωπητών. Το στοιχείο F μελετήθηκε περαιτέρω για την επίδρασή του στην έκφραση του γονιδίου της λουσιφεράσης, υπό τον υποκινητή του ᴳγ γονιδίου και απουσία του ενισχυτή SV40 και παρατηρήθηκε πολύ χαμηλή έκφραση του γονιδίου της λουσιφεράσης επιβεβαιώνοντας την ισχυρή αποσιωπητική δράση του στοιχείου αυτού. Διερεύνηση του in vivo ρόλου των στοιχείων Enh και F, μέσω αφαίρεσής τους με ομόλογο ανασυνδυασμό. Μελετήθηκε ο ρόλος των στοιχείων Enh και F σε διαγονιδιακά ποντίκια, με την αφαίρεσή τους, μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού, από ένα PAC που συμπεριελάμβανε ολόκληρο το σύμπλεγμα των β-γονιδίων των σφαιρινών. Αναπτύχθηκε και χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα ομόλογου ανασυνδυασμού, στα κύτταρα E. coli DH10B (Imam et al., 2000). Δημιουργήθηκε ένα τροποποιημένο PAC με έλλειψη των αποσιωπητών Enh και F, το οποίο ενέθηκε σε γονιμοποιημένα αυγά ποντικών. Από τις μικροένεσεις προέκυψαν 3 διαγονιδιακά ποντίκια και εδραιώθηκαν δύο διαγονιδιακές σειρές. Η ανάλυση της έκφρασης των ανθρώπινων ε, γ και β γονιδίων έγινε με ανάλυση S1 νουκλεάσης στο πρώιμο εμβρυϊκό στάδιο των 10.5 ημερών, στο όψιμο εμβρυϊκό στάδιο των 12.5 και 16.5 ημερών και στο ενήλικο στάδιο. Στο πρώιμο εμβρυϊκό στάδιο παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση των γ και ε γονιδίων (Κατσαντώνη et al., 2001). Φαίνεται ότι τα στοιχεία Enh και F παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης των εμβρυϊκών γονιδίων στο πρώιμο εμβρυϊκό στάδιο και η αφαίρεσή τους επηρεάζει θετικά το συνολικό μεταγραφικό μηχανισμό των ανθρώπινων γονιδίων. Τα στοιχεία αυτά φαίνεται ότι είναι ειδικά αποσιωπητικά στοιχεία του πρώιμου εμβρυϊκού σταδίου. Στα υπόλοιπα αναπτυξιακά στάδια δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην έκφραση των ανθρώπινων γονιδίων, γεγονός που υποδηλώνει ότι ίσως άλλα στοιχεία να παίζουν σημαντικότερο ρόλο μόνα ή και σε συντονισμό με τα Enh και F, για την πλήρη αποσιώπηση των γ γονιδίων στο ενήλικο στάδιο και τη μεταστροφή της αιμοσφαιρίνης. Για την περαιτέρω διερεύνηση της μεταγραφής των γονιδίων πραγματοποιήθηκαν RNA in situ υβριδισμοί. Πραγματοποιήθηκε και FISH για τη μελέτη της ένθεσης των διαγονιδίων στο γονιδίωμα του ποντικού. Η στοχευμένη αφαίρεσή των στοιχείων Enh και F μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού δημιουργεί νέες δυνατότητες για την επανενεργοποίηση των γ γονιδίων για θεραπευτικό σκοπό. Διερεύνηση του in vivo ρόλου των ενισχυτών HPFH-2, HPFH-3 και HPFH-6. Ο ρόλος των ενισχυτών HPFH-2, HPFH-3 και HPFH-6 διερευνήθηκε σε διαγονιδιακά ποντίκια χρησιμοποιώντας κοσμιδιακές κατασκευές με το LCR του συμπλέγματος των β-γονιδίων των σφαιρινών, το ᴬγ γονίδιο με τους αποσιωπητές Enh και F και έναν ενισχυτή HPFH. Σαν control χρησιμοποιήθηκε η κατασκευή που συμπεριελάμβανε το LCR και το ᴬγ γονίδιο με τους αποσιωπητές Enh και F. Η έκφραση του ᴬγ γονιδίου αναλύθηκε σε όλες τις διαγονιδιακές σειρές που προέκυψαν από τις μικροενέσεις, στο ενήλικο στάδιο με ανάλυση S1 νουκλεάσης. Σε αρκετές των διαγονιδιακών σειρών (οι περισσότερες εκ των οποίων είχαν πολλά αντίγραφα των κατασκευών) παρατηρήθηκαν παρουσία των ενισχυτών υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του Αγ γονιδίου σε σύγκριση με τις control διαγονιδιακές σειρές (Katsantoni et al., 2000, 2001). Οι σειρές με πολλά αντίγραφα της κατασκευής διασταυρώθηκαν με διαγονιδιακές σειρές cre, για να μπορέσουν να δημιουργηθούν διαγονιδιακές σειρές μονού αντιγράφου. Ακολούθησε ανάλυση της έκφρασης του ᴬγ γονιδίου στο όψιμο εμβρυϊκό στάδιο των 12.5 και 16.5 ημερών και στο ενήλικο στάδιο των διαγονιδιακών σειρών μονού αντιγράφου με ανάλυση S1 νουκλεάσης (Katsantoni et al., 2001). Το φαινόμενο της μεταστροφής της αιμοσφαιρίνης και η αποσιώπηση του Αγ γονιδίου ήταν εμφανή σε όλες τις διαγονιδιακές σειρές. Οι διαγονιδιακές σειρές της control κατασκευής παρουσίασαν μηδενική έκφραση του ᴬγ γονιδίου στο ενήλικο στάδιο, αφού το γονίδιο αυτό είχε αποσιωπηθεί. Οι διαγονιδιακές σειρές HPFH-2C και η HPFH-6A παρουσίασαν έκφραση του γονιδίου στο ενήλικο στάδιο και αυξημένη έκφραση του γονιδίου και στα στάδια των 12.5 και 16.5 ημερών. Αυξημένη έκφραση του γονιδίου στα στάδια των 12.5 και 16.5 ημερών παρατηρήθηκε και στη διαγονιδιακή σειρά HPFH-2F. Χαρτογραφήθηκαν οι ενθέσεις των διαγονιδίων με FISH και διαπιστώθηκε ότι οι ενισχυτές HPFH-2 και HPFH-6 δουλεύουν in vivo και εκφράζουν το εμβρυϊκό ᴬγ γονίδιο στο ενήλικο στάδιο, όταν υποβοηθούνται από θετικά φαινόμενα θέσεως. H παρουσία τους αυξάνει την έκφραση του ᴬγ γονιδίου στο εμβρυϊκό και στο ενήλικο στάδιο. Παρατηρήθηκε συσχέτιση της έκφρασης με την ένθεση σε περιοχές του χρωμοσώματος που ήταν μακριά από το κεντρομερίδιο και το τελομερίδιο και που πιθανώς να αντιστοιχούν σε ευχρωματίνη. Ισχυρότερος βρέθηκε να είναι ο ενισχυτής HPFH-2. Παρουσία του ενισχυτή HPFH-3 δεν παρατηρήθηκε έκφραση του ᴬγ γονιδίου στο ενήλικο στάδιο, παρά τις ενθέσεις μακριά από το κεντρομερίδιο και το τελομερίδιο, άρα ο ενισχυτής αυτός δεν δούλεψε στις διαγονιδιακές σειρές που μελετήθηκαν. Οι διαγονιδιακές σειρές HPFH-2C και HPFH-6A που παρουσίασαν έκφραση του ᴬγ γονιδίου στο ενήλικο στάδιο ελέγχθηκαν και για την κατανομή της έκφρασης του γονιδίου μεταξύ των κυττάρων και η κατανομή βρέθηκε παγκυτταρική, όπως και στην περίπτωση των HPFH ετεροζυγωτών. Τα μοντέλα HPFH ποντικών που δημιουργήσαμε επιβεβαίωσαν την υπόθεση της παραμονής της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης στα σύνδρομα HPFH, λόγω της διαμετάθεσης ενισχυτών από το 3’ άκρο του συμπλέγματος προς τα εμβρυϊκά γονίδια. Οι ενισχυτές HPFH-2 και ΗPFΗ-6, όταν υποβοηθούνται από θετικά φαινόμενα θέσεως, έχουν τη δυνατότητα να εκφράζουν το εμβρυϊκό ᴬγ γονίδιο στο ενήλικο στάδιο, έστω και σε μικρό ποσοστό, γεγονός που δίνει νέες δυνατότητες στη χρησιμοποίησή τους σε φορείς γονιδιακής θεραπείας για την αύξηση της έκφρασης του μεταφερόμενου θεραπευτικού εμβρυϊκού γονιδίου.