ΜΕΛΕΤΗ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΣΤΟΝ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟ THERMUS THERMOPHILUS

Abstract

ΣΤΗ ΠΑΡΟΥΣΑ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΔΙΑΧΩΡΙΣΤΗΚΑΝ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΟΙ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΤΗΣ 305 ΥΠΟΜΟΝΑΔΕΣ ΤΟΥ ΘΕΡΜΟΦΙΛΟΥ ΒΑΚΤΗΡΙΟΥ THERMUS THERMOPHILUS.ΟΙ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΕΚΧΥΛΙΣΤΗΚΑΝ ΑΠΟ ΤΗΝ 305 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑ ΜΕ ΟΞΙΚΟ ΟΞΥ ΚΑΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΤΗΚΑΝ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕ ΣΗΣ ΣΕ ΣΥΣΤΗΜΑ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ .Η ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥΣ ΕΓΙΝΕ ΜΕ ΕΥΡΕΣΗ ΤΗΣ ΑΜΙΝΟΤΕΛΙΚΗΣ ΑΜΙΝΟΞΙΚΗΣ ΑΚΟΛΟΥΘΙΑΣ ΤΟΥΣ ΜΕ ΑΠΑΝΟΔΟΜΗΣΗ ΚΑΤΑ EDMAN ΚΑΙ ΜΕ ΔΙΣΔΙΑΣΤΑΤΗ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ .Η ΟΝΟΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΔΟΘΗΚΕ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗΝ ΟΜΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΠΡΩΤΟΤΑΓΟΥΣ ΤΟΥΣ ΔΟΜΗΣ ΜΕ ΤΙΣ ΓΝΩΣΤΕΣ ΑΚΟΛΟΥΘΙΕΣ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΩΝ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΑΛΛΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ .ΑΠΟ ΤΙΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΤΗΣ 305 ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΟΥ Τ. THERMOPILUS ΑΠΟΜΟΝΩΘΗΚΕ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΕ Η ΠΡΩΤΕΙΝΗ 514.Η ΠΡΩΤΟΤΑΓΗΣ ΔΟΜΗ ΤΗΣ 514 ΒΡΕΘΗΚΕ ΤΟΣΟ ΣΕ ΕΠΙΠΕΔΟ ΠΡΩΤΕΙΝΗΣ ΟΣΟ ΚΑΙ ΣΕ ΕΠΙΠΕΔΟ DNA .Η ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΕΧΕΙ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΑΖΑ 7000DA ΚΑΙ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΣΗΜΕΙΟ 11,94.ΠΕΡΙΕΧΕΙ 4 ΚΥΣΤΕΙΝΕΣ , ΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΣΧΗΜΑΤΙΖΟΥΝ ΜΙΑ ΔΟΜΗΔΑΚΤΥΛΙΟΥ ZN ΤΟΥ ΤΥΠΟΥ C2-C2 .ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ S14 ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΠΛΑΣΜΙΔΙΟ PET ΚΑΙ ΑΚΟΛΟΥΘΗΣΕ ΥΠΕΡΠΑΡΑ ΓΩΓΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΙΝΗΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ E. COLI.Η ΥΠΕΡΠΑΡΑΓΟΜΕΝΗ S14 ΚΑΘΑΡΙΣΤΗΚΕ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΔΥΟ ΣΤΗΛΩΝ ΙΟΝΤΙΚΗΣ ΑΛΛΑΓΗΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΑΤΟΜΙΚΗΣ ΥΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΣΤΗΝ ΚΑΘΑΡΗ S14 ΕΔΕΙΞΑΝ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ZN ΣΕ ΣΤΟΙΧΕΙΟΜΕΤΡΙΑ 1:1.

IN THE PRESENT THESIS THE TOTAL PROTEIN MIXTURE OF THE 305 RIBOSOMAL SUBUNIT OF T. THERMOPHILUS WAS PURIFIED USING REVERSE PHASE HPLC.THE PROTEINS WERE IDENTIFIED BOTH BY TWO DIMENSIONAL GEL ELECTROPHORESIS AN BY AMINO - TERMINAL AMINOACID SEQUENCE ANALYS IS .THE PROTEINS WERE NUMBERED ACCORDING TO THEIR PRIMARY STRUCTURAL SIMILARITY TO KNOWN RIBOSOMAL PROTEINS .RIBOSOMAL PROTEIN S14IS ONE OF THE 20 PROTEINS THAT WERE CHARACTERISED FROM THE 305 SUBUNIT OF T.THERMOPHYLUS.THE AMINO ACID SEQUENCE OF 514 WAS DETERMINED BOTH BY SEQUENCEANALYSIS OF THE INTACT PROTEIN AS WELL AS BY DNA SEQUENCE ANALYSIS OF THE GENE .THE PROTEIN CONTAINS 60 AMINOACID RESIDUES WITH A MOLECULAR MASS OF 7000DAAND ATHEORETICALLY PREDICTED ISOELECTRIC POINT OF 11,94.COMPARISON OF T HE AMINOACID SEQUENCE OF 514 TO HOMOLOOGOUS PROTEINS FROM OTHER SPECIES REVEALEDA HIGH TECHNOLOGY IN THE CARBOXY - TERMINAL REGION WHERE A ZINC FINGER MOTIFOF THE C2C2 VARIETY IS FORMED .THE 514 GENE WAS CLONED AND THE PROTEIN WAS OVERPRODUCED IN E. CO LI CELLS .THE OVERPRODUCED 514 WAS PURIFIED BY MEANS OFION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY .ATOMIC ABSORPTION MEASUREMENTS SHOWED THAT THE PURIFIED PROTEIN CONTAINS ZINC IN AMOLAR RATIO OF ONE.