Χαρακτηρισμός μεσεγχυματικών κυττάρων προερχόμενων από επαγόμενα βλαστοκύτταρα για τη μοντελοποίηση της εκφυλιστικής αρθρίτιδας

Abstract

Osteoarthritis (OA) is the most prevalent degenerative joint disorder and a leading cause of pain and disability worldwide. It is no longer considered as a passive consequence of mechanical wear but as a dynamic, inflammatory, and multifactorial disease driven by the interplay of genetic, biomechanical, metabolic, and environmental factors. At the molecular level, OA is characterized by complex regulatory processes: alterations in the nuclear transcriptome disrupt pathways essential for cellular homeostasis, while dysregulation of non-coding RNAs (ncRNAs) perturbs the mRNA-ncRNA regulatory network, shifting the balance from anabolic toward catabolic and inflammatory processes. In parallel, increasing evidence highlights the role for the mitochondrial genome (mtDNA) in OA pathogenesis, as mtDNA variants and mitochondrial dysfunction are linked to accelerated cellular aging and loss of tissue integrity. Despite extensive research, there are no disease-modifying drugs and current clinical interventions are restricted to symptom management or surgical approaches in advanced disease stages. Mesenchymal stem cell (MSC)-based therapies are promising due to their regenerative and immunomodulatory capacity; however, their efficacy is influenced by the tissue of origin and the age/pathological condition of the donor, factors that limit their therapeutic potential. The reprogramming of induced pluripotent stem cells (iPSCs) and their differentiation into induced MSCs (iMSCs) offers a potential solution, enabling the generation of homogeneous cell populations with superior regenerative potential and suitability for disease modeling. The present PhD thesis employed a multi-omics approach, including mRNA transcriptomics, miRNA/lncRNA profiling and mtDNA variant analysis, to investigate the molecular changes occurring during the reprogramming of MSCs from OA patients into iPSCs and their subsequent differentiation into iMSCs. The objectives were to (i) elucidate the regulatory mechanisms underlying the restored biological functionality of iMSCs compared to primary MSCs, and (ii) assess whether iMSCs can serve both as an OA disease model and a candidate cell source for future regenerative applications. The experimental workflow comprised: (a) reprogramming patient-derived MSCs into iPSCs and generation of iMSCs via embryoid body (EB) formation, (b) comparative transcriptomic and ncRNA expression analyses across MSCs, iPSCs, and iMSCs, and (c) characterization of mtDNA heteroplasmy and variant burden across the same populations. Phenotypic and functional characterization confirmed successful induction of pluripotency and subsequent differentiation into iMSCs, which exhibited a mesenchymal profile (CD73⁺/CD90⁺/CD105⁺) and preserved trilineage differentiation capacity (adipogenic, chondrogenic, osteogenic). Transcriptomic analysis revealed 209 differentially expressed genes (DEGs) between iMSCs and OA-derived MSCs. One hundred and nineteen (119) out of the 209 DEGs shared common expression patterns with iPSCs, indicating that iMSCs acquired transcriptional features of pluripotency and entered a “rejuvenated” state. SFRP1/2, HMGA2, and FLT1 were among genes that were associated with increased proliferative potential, while genes including SEMA3 and TNFRSF21 were linked to MSC migration and differentiation. Integrated mRNA-miRNA profiling identified 43 DEGs regulated by 15 inversely expressed miRNAs, as hsa-let-7b/i, hsa-miR-195-5p, and hsa-miR-16-5p. Subsequent mRNA-miRNA-lncRNA network analysis uncovered a distinct competing endogenous RNA regulatory network (ceRNA) emerging during reprogramming. Central regulatory nodes included ADAMTS5, MAP3K9, HMGA2, and COL12A1, whereas lncRNAs, as MEG3, SNHG14, MIR100HG, NR2F2-AS1 and miRNAs, as hsa-miR-145, and hsa-miR-195 acted as key upstream regulators. The above findings demonstrate that reprogramming reshapes the ncRNA-mRNA regulatory landscape, reversing OA pathological molecular signatures. Mitochondrial genome analysis revealed that OA-derived MSCs exhibited high burden of heteroplasmic mtDNA variants, predominantly in OXPHOS coding regions as MT-ND1–ND4, MT-ATP8, MT-CO1 and ribosomal RNA genes, as MT-RNR1, and MT-RNR2, including variants with high pathogenicity scores. Following reprogramming and differentiation into iMSCs, the mtDNA variant load decreased, with several variants being nearly eliminated, indicating a mechanism of mitochondrial genome purification. Integration with transcriptomic data revealed five mitochondria-associated genes, COX7A1, GPAT2, MAOB, SERAC1, ECHDC2 with reduced expression in iMSCs, consistent with metabolic remodeling and restoration of mitochondrial homeostasis. In conclusion, this thesis demonstrates that reprogramming of MSCs from OA patients into iPSCs and their subsequent differentiation into iMSCs leads to profound transcriptional and mitochondrial rejuvenation, mediated through both reconfiguration of the ceRNA regulatory network and reduction of pathogenic mtDNA variants. Collectively, these findings establish iMSCs as a functionally restored cell population with enhanced biological properties and elevated therapeutic potential, supporting their use as a powerful platform for osteoarthritis modeling and possible future OA regenerative stem cell therapies.

Η εκφυλιστική αρθρίτιδα ή οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) αποτελεί τη συχνότερη εκφυλιστική νόσο των αρθρώσεων και βασική αιτία πόνου και αναπηρίας παγκοσμίως. Σήμερα δεν θεωρείται μια απλή μηχανική φθορά, αλλά μια ενεργή, φλεγμονώδης και πολυπαραγοντική νόσος, αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης γενετικών, περιβαλλοντικών και μηχανικών παραγόντων. Σε μοριακό επίπεδο, η ΟΑ αποτελεί αποτέλεσμα πολύπλοκων ρυθμιστικών διεργασιών. Το πυρηνικό μεταγραφικό προφίλ (mRNAs) των κυττάρων των διαφόρων ιστών της άρθρωσης μεταβάλλεται σημαντικά, προκαλώντας διαταραχή σε κρίσιμους μηχανισμούς λειτουργίας τους. Ταυτόχρονα, ο ρόλος των μη-κωδικών μορίων RNA (ncRNAs) έχει αναγνωριστεί ως καίριος και η απορρύθμιση του δικτύου αλληλεπιδράσεων mRNAs και ncRNAs διαταράσσει την ισορροπία μεταξύ αναβολικών και καταβολικών διεργασιών συμβάλλοντας στην εκφυλιστική πορεία της νόσου. Επιπλέον, πέρα από τις αλλαγές στο επίπεδο του πυρηνικού γονιδιώματος, η λειτουργικότητα των κυττάρων της άρθρωσης επηρεάζεται και από το μιτοχονδριακό γονιδίωμα (mtDNA). Οι παραλλαγές του mtDNA και η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία έχουν συνδεθεί με την επιτάχυνση της κυτταρικής γήρανσης ενισχύοντας την παθογένεση της ΟΑ. Μέχρι σήμερα, αποτελεσματικές θεραπείες τροποποίησης της νόσου δεν υπάρχουν. Οι διαθέσιμες κλινικές παρεμβάσεις περιορίζονται στη συμπτωματική αντιμετώπιση του πόνου και στα τελικά στάδια σε χειρουργικές επεμβάσεις. Οι κυτταρικές θεραπείες με την χρήση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (MSCs) αποτελούν υποσχόμενη στρατηγική λόγω της αναγεννητικής και ανοσοτροποποιητικής τους δράσης. Ωστόσο, η βιολογική τους ποιότητα επηρεάζεται από τον ιστό προέλευσης και την ηλικία/παθολογική κατάσταση του δότη, γεγονός που περιορίζει το θεραπευτικό τους δυναμικό. Η εισαγωγή των επαγόμενων μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (iMSCs) προερχόμενων από επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (iPSCs), προσφέρει λύση σε αυτά τα εμπόδια, επιτρέποντας την παραγωγή ομοιογενούς κυτταρικού υλικού, με αυξημένες αναγεννητικές δυνατότητες και με πιθανές εφαρμογές τόσο σε κυτταρικές θεραπείες, όσο και στη μοντελοποίηση της πάθησης. Η παρούσα διδακτορική διατριβή, βασιζόμενη σε μια «πολυ-ωμική» προσέγγιση που περιλαμβάνει την ανάλυση του μεταγραφικού προφίλ (mRNAs), του προφίλ των μη-κωδικών RNA (miRNAs και lncRNAs) και του μιτοχονδριακού γονιδιώματος (mtDNA) εξετάζει τις μεταβολές που συντελούνται κατά τον επαναπρογραμματισμό και τη διαφοροποίηση των MSCs σε iPSCs και iMSCs. Στόχος είναι ο εντοπισμός των μοριακών μηχανισμών που αποκαθιστούν τη βιολογική λειτουργικότητα των iMSCs έναντι των πρωτογενών MSCs, η αξιολόγησή τους τόσο ως μοντέλο μελέτης της ΟΑ καθώς και ως πιθανών θεραπευτικών εργαλείων. Το πειραματικό σκέλος της παρούσας διατριβής οργανώθηκε σε τρία επίπεδα: α) την εφαρμογή λειτουργικού πρωτοκόλλου διαφοροποίησης των MSCs, που ελήφθησαν από ασθενείς με ΟΑ (MSC_OA) και φυσιολογικούς δότες, σε iPSCs και iMSCs, β) τη διερεύνηση των αλλαγών στο μεταγραφικό (mRNA) και ncRNA προφίλ όλων των παραγόμενων κυτταρικών τύπων (MSCs, iPSCs και iMSCs) και γ) την ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματός (mtDNA) τους. Αρχικά, τα iPSCs που προήλθαν από MSCs μυελού των οστών ατόμων με ΟΑ, διαφοροποιήθηκαν σε iMSCs μέσω σχηματισμού εμβρυοειδών σωματίων (Embryoid Bodies, EBs). Τα παραγόμενα iMSCs αξιολογήθηκαν φαινοτυπικά και λειτουργικά. Επιβεβαιώθηκε η απόκτηση μεσεγχυματικού φαινοτύπου μέσω θετικής έκφρασης των επιφανειακών δεικτών CD73, CD90 και CD105, καθώς και αντίστοιχων γονιδιακών δεικτών (VEGFA, Vimentin, EMP1, PDGFRβ). Παράλληλα, τα iMSCs διατήρησαν την πολυδυναμικότητά τους, παρουσιάζοντας ικανότητα τριπλής διαφοροποίησης σε λιποκύτταρα, χονδροκύτταρα και οστεοκύτταρα. Σε μεταγραφικό επίπεδο, η συγκριτική ανάλυση μεταξύ iMSCs και MSCs_OA αποκάλυψε 209 διαφοροποιημένα γονίδια (DEGs). Από αυτά, 119 παρουσίασαν προφίλ έκφρασης παρόμοιο με εκείνο των iPSCs, υποδηλώνοντας ότι τα iMSCs διατηρούν μεταγραφικά χαρακτηριστικά της πολυδύναμης κατάστασης και εμφανίζουν πρότυπο «αναζωογόνησης». Γονίδια όπως τα SFRP1/2, HMGA2, FLT1 σχετίστηκαν με αυξημένη κυτταρική αύξηση και πολλαπλασιασμό, ενώ άλλα όπως τα SEMA3, TNFRSF21 συνδέθηκαν με μετανάστευση και διαφοροποίηση των MSCs. Ο συνδυασμός της ανάλυσης μεταγραφώματος με τα δεδομένα ανάλυσης προφίλ έκφρασης των miRNA εντόπισε 43 DEGs που πιθανώς ρυθμίζονται από 15 miRNAs με αντίστροφο μοτίβο έκφρασης, όπως τα hsa-let-7b/i, hsa-miR-195-5p, hsa-miR-16-5p. Η ανάλυση εμπλουτισμού έδειξε ότι τα μόρια αυτά εμπλέκονται σε κρίσιμες διεργασίες, όπως κυτταρική αύξηση, μετανάστευση και χονδρογένεση. Η ολοκληρωμένη διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων mRNAs-miRNAs-lncRNAs ανέδειξε ένα ενδογενές ανταγωνιστικό δίκτυο RNA (ceRNA network) που διαφοροποιείται κατά τον επαναπρογραμματισμό. Κεντρικοί ρυθμιστικοί κόμβοι του δικτύου ήταν τα γονίδια ADAMTS5, MAP3K9, HMGA2 και COL12A1, ενώ τα μακρά μη κωδικά RNA (lncRNAs) MEG3, SNHG14, MIR100HG και NR2F2-AS1 και miRNA, όπως τα hsa-miR-145 και hsa-miR-195 λειτούργησαν ως κύριοι ρυθμιστές. Συνολικά, τα δεδομένα δείχνουν ότι ο επαναπρογραμματισμός αποκαθιστά ένα νέο ρυθμιστικό ceRNA δίκτυο, το οποίο «αντιστρέφει» την έκφραση παθολογικών μορίων των MSCs_OA και συμβάλλει στη λειτουργική αναζωογόνηση των iMSCs. Τέλος, η ανάλυση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος έδειξε ότι τα πρωτογενή MSCs από ασθενείς με ΟΑ εμφανίζουν αυξημένο αριθμό ετεροπλασματικών παραλλαγών (SNVs), κυρίως σε κωδικές περιοχές γονιδίων της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης (OXPHOS), με χαρακτηριστικές θέσεις συσσώρευσης παραλλαγών, «hotspots», στα μιτοχονδριακά γονίδια MT-ND1–ND4, MT-ATP8 και MT-CO1, καθώς και στα ριβοσωμικά γονίδια MT-RNR1 και MT-RNR2. Πολλές από αυτές τις παραλλαγές εμφάνισαν υψηλό παθογονικό δυναμικό. Μετά τον επαναπρογραμματισμό σε iPSCs και την περαιτέρω διαφοροποίηση σε iMSCs, το φορτίο των παραλλαγών μειώθηκε δραστικά, με τις περισσότερες να εξαλείφονται σχεδόν πλήρως, υποδεικνύοντας «καθαρισμό» του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. Παράλληλα, η σύγκριση των διαφοροποιημένα εκφραζόμενων γονιδίων με τα μιτοχονδριακά δεδομένα, αποκάλυψε πέντε γονίδια τα COX7A1, GPAT2, MAOB, SERAC1, ECHDC2 που συνδέονται άμεσα με τη μιτοχονδριακή λειτουργία και παρουσιάζουν μειωμένη έκφραση στα iMSCs, ένδειξη μεταβολικής αναπροσαρμογής και πιθανής βελτίωσης της μιτοχονδριακής ομοιόστασης κατά την αναζωογόνηση των κυττάρων. Τα αποτελέσματα της διδακτορικής διατριβής δείχνουν ότι ο επαναπρογραμματισμός των MSCs από ασθενείς με ΟΑ σε iPSCs και η επαναδιαφοροποίησή τους σε iMSCs οδηγεί σε καθολική μεταγραφική και μιτοχονδριακή «αναζωογόνηση» των κυττάρων. Η παραπάνω ολοκληρωμένη προσέγγιση ανέδειξε τη διαμόρφωση ενός νέου ceRNA δικτύου, το οποίο επαναρυθμίζει παθολογικούς άξονες γονιδιακής έκφρασης των MSCs προερχόμενων από ασθενείς με OA. Παράλληλα, ο δραστικός «καθαρισμός» των ετεροπλασματικών παραλλαγών στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα υποδηλώνει την πιθανή αποκατάσταση της μιτοχονδριακής ομοιόστασης των κυττάρων. Συνολικά, τα ευρήματα τεκμηριώνουν ότι τα επαγόμενα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (iMSCs) αποτελούν ένα κυτταρικό πληθυσμό με βελτιωμένα βιολογικά χαρακτηριστικά και αυξημένο θεραπευτικό δυναμικό, καθιστώντας τα ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για τη μοντελοποίηση της ΟΑ και πιθανές μελλοντικές κυτταρικές θεραπείες της ΟΑ.