Γενετικές διαφορές και πατρική συνεισφορά στο ελεύθερο εμβρυϊκό DNA στη μητρική κυκλοφορία κατά την κύηση

Abstract

B-thalassemia is a disease caused by highly heterogeneous inherited disorders of beta-globin gene expression. More than 170 different beta-globin gene mutations have been described worldwide. Most of these mutations are point mutations that result from a single nucleotide exchange. The detection of these monogenic disorders demands sensitive procedures so as to distinguish the mutant from the normal allele. The prenatal genetic diagnosis of these mutations relies on invasive procedures such as amniocentesis or chorionic villous sampling (CVS), however, each carries a small but finite risk of fetal loss and injury. The detection of intact fetal cells and cell-free fetal DNA in maternal circulation during pregnancy has put forward the use of non invasive prenatal diagnosis. Intact fetal cells have been used in a single cell polymerase chain reaction for the non invasive prenatal diagnosis of hemoglobinopathies. The majors limitations in applying these techniques clinically is the generally low number of fetals cells in maternal circulation during pregnancy and the complexity of the requested procedures. In contrast, the cell-free fetal DNA analysis has the advantage of being rapid and reliable. The chromosomal regions bearing the mutant alleles are in strong disequilibrium to polymorphism haplotypes and their analysis has led to prenatal diagnosis of β-thalassemia. In this study, the information content of the polymorphisms and mutations in beta globin gene mutation carriers families was compared so as to find the best marker for non invasive prenatal detection of beta thalassemia. In addition, cell-free fetal DNA was used for the non invasive detection of β-globin gene mutations and the fetal gender determination. From the β-globin gene mutation analysis in the mutation carrier group, with the ARMS and DGGE techniques, the percentage of each mutation was found. The 80.4 % of the couples presented informative mutations, namely different paternal and maternal mutations. The β-globin gene polymorphism analysis in the mutation carrier group and the control group, with the PCR-RFLP procedures, revealed the percentage of the couples that present at least one informative polymorphism. The 39% of the mutation carrier couples and the 29% of the control couples presented different paternal and maternal polymorphisms. In addition, the information content percentage of each polymorphism was found. From the mutation and polymorphism correlation, a specific haplotype was found for every mutation. From the mutation analysis, it was found that IVSI-110 is the most frequent mutation. The non invasive detection of the IVSI-110 mutation of the beta globin gene and the Hb Lepore gene was achieved. For the detection of the paternal contribution, DYS14 and DYZ1 Y chromosome-specific STSs were used. The detection rate of the fetal gender determination was found to be 100%. In addition, in contrast to previous studies it was found that the fetal DNA remains 24h postpartum and in higher concentrations than those at the 7th week of pregnancy. In conclusion, from the mutation and polymorphism correlation, it was found that the mutations constitute a better marker for the non invasive prenatal detection of β-thalassemia syndromes. In addition, maternal serum has been used successfully to identify non invasively paternally inherited mutations of the beta-globin gene and Y chromosome-specific sequences, indications of paternal genetic contribution in maternal circulation, at the 7th-9th week of pregnancy. In near future, non invasive prenatal detection techniques will be used as a “pre-test” prior to invasive procedures such as amniocentesis or chorionic villous sampling.

Η β-μεσογειακή αναιμία είναι μία αυτοσωματική υπολειπόμενη νόσος που οφείλεται σε ετερογενείς διαταραχές της έκφρασης του γονιδίου της β-σφαιρίνης. Περισσότερες από 170 διαφορετικές μεταλλάξεις του γονιδίου της β-σφαιρίνης έχουν περιγραφεί. Οι περισσότερες από τις μεταλλάξεις του γονιδίου της β-σφαιρίνης είναι σημειακές μεταλλάξεις και οφείλονται σε μονονουκλεοτιδικές αλλαγές. Η ανίχνευση τους απαιτεί ευαίσθητες τεχνικές, ώστε να διαχωριστεί το μεταλλαγμένο από το φυσιολογικό αλληλόμορφο. Η προγεννητική διάγνωση αυτών των μεταλλάξεων βασίζεται σε επεμβατικές μεθόδους όπως η αμνιοπαρακέντηση και η λήψη χοριακών λαχνών, οι οποίες όμως, παρουσιάζουν μικρό αλλά αξιοσημείωτο κίνδυνο για την υγεία του εμβρύου. Η ανίχνευση λειτουργικών εμβρυϊκών κυττάρων και ελεύθερου εμβρυϊκού DNA στη μητρική κυκλοφορία κατά τη διάρκεια της κύησης έκανε εφικτή την μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση. Λειτουργικά εμβρυϊκά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ενός κυττάρου για τη μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση των αιμοσφαιρινοπαθειών. Οι κύριοι περιορισμοί για τη χρήση των τεχνικών αυτών σε κλινική βάση είναι ο χαμηλός αριθμός εμβρυϊκών κυττάρων κατά τη διάρκεια της κύησης και η πολυπλοκότητα των τεχνικών αυτών. Αντίθετα, η ανάλυση του ελεύθερου εμβρυϊκού DNA εξασφαλίζει γρήγορα και αξιόπιστα αποτελέσματα. Οι χρωμοσωμικές περιοχές που φέρουν τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα βρίσκονται σε ισχυρή ισορροπία με τους απλοτύπους των πολυμορφισμών και η ανάλυσή τους βοηθά την προγεννητική διάγνωση της β-μεσογειακής αναιμίας. Στην παρούσα μελέτη, συγκρίθηκε η πληροφοριακότητα των μεταλλάξεων και των πολυμορφισμών του γονιδίου της β-σφαιρίνης ώστε να βρεθεί ο καλύτερος δείκτης για τη μη επεμβατική προγεννητική ανίχνευση των β-αιμοσφαιρινοπαθειών. Το ελεύθερο εμβρυϊκό DNA χρησιμοποιήθηκε επίσης για την μη επεμβατική ανίχνευση των μεταλλάξεων της β-σφαιρίνης και του εμβρυϊκού φύλου. Από την ανάλυση των μεταλλάξεων των γονιδίων του β-συμπλέγματος της σφαιρίνης στα 96 ζευγάρια φορέων με τις μεθόδους ARMS και DGGE βρέθηκε το ποσοστό εμφάνισης της κάθε μετάλλαξης. Το 80.4 % των ζευγαριών παρουσίαζε πληροφοριακές μεταλλάξεις , δηλαδή διαφορετική πατρική και μητρική μετάλλαξη. Η ανάλυση των πολυμορφισμών του γονιδίου της β-σφαιρίνης, στους δύο πληθυσμούς ατόμων, με τεχνικές PCR-RFLPs αποκάλυψε ότι το 39% των ζευγαριών ετεροζυγωτών και το 29% των ζευγαριών του γενικού πληθυσμού παρουσιάζουν τουλάχιστον ένα πληροφοριακό πολυμορφισμό. Επίσης βρέθηκε η πληροφοριακότητα κάθε πολυμορφισμού. Από τη συσχέτιση των μεταλλάξεων με τους πολυμορφισμούς βρέθηκε συγκεκριμένος απλότυπος για κάθε μετάλλαξη. Βρέθηκε επίσης ότι η IVSI-110 είναι η συχνότερη μετάλλαξη. Με τη χρήση μητρικού ορού ως πηγή ελεύθερου εμβρυϊκού DNA επιτεύχθηκε η μη επεμβατική ανίχνευση της IVSI-110 μετάλλαξης του β-γονιδίου της σφαιρίνης και του γονιδίου Hb Lepore. Για την ανίχνευση της πατρικής συνεισφοράς, οι DYS14 και DYZ1 αλληλουχίες του χρωμοσώματος Υ χρησιμοποιήθηκαν με ευαισθησία και ειδικότητα 100%. Επίσης, σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες, βρέθηκε ότι το DNA παραμένει στη μητρική κυκλοφορία 24 ώρες μετά τον τοκετό και σε υψηλότερες συγκεντρώσεις από την 7η εβδομάδα της κύησης. Οι μεταλλάξεις αποτελούν καλύτερους δείκτες για την μη επεμβατική προγεννητική ανίχνευση των αιμοσφαιρινοπαθειών από τους πολυμορφισμούς. Το ελεύθερο εμβρυϊκό DNA χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς για την μη επεμβατική ανίχνευση πατρικά κληρονομούμενων μεταλλάξεων του γονιδίου της β-σφαιρίνης και του χρωμοσώματος Υ, δείκτες της πατρικής συνεισφοράς στη μητρική κυκλοφορία την 7η με 9η εβδομάδα της κύησης. Στο άμεσο μέλλον, θα είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν οι τεχνικές μη επεμβατικής προγεννητικής ανίχνευσης σαν ένα “τέστ” πριν τις επεμβατικές μεθόδους, όπως η αμνιοπαρακέντηση και η λήψη χοριακών λαχνών.