Πειραματική μελέτη για την ανάδειξη των παθογενετικών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του ωοθυλακίου και τη χρήση τους στην πρόωρη ωοθηκική ανεπάρκεια

Abstract

The preservation of reproductive life through inhibition of the process that exhausts the available stock of follicles,is an important condition for the duration of fertility.The emergence of pathogenetic mechanisms involved in the developmental stages of the follicle is the most important factor and therefore the key question of whether follicular cessation and activation can be achieved is the goal of this research project.Increased apoptotic death and eventual stock depletion of primordial follicles is a common feature of premature ovarian failure and patients receiving anticancer therapy. Controlling follicular growth through cessation and reactivation contributes significantly to understanding this evolutionary process.The aim of this study is to examine if the inhibition of primordial follicles and the subsequent activation can be achieved by the transient inhibition of mTOR.In the current thesis took place three studies: an experimental study for the inhibition of follicular development,treatment with everolimus and verapamil, a systematic review of the paths involved in POF and a preclinical trial for the therapy of progesterone and estradiol or a combination of these two for the retention of primordial follicles. Methods:in the first investigation,45 female rats were randomized in 5 groups.Groups received Everolimus, Everolimus+Verapamil,Everolimus+Fisetin and Fisetin alone.Outcomes were measured in the left ovary after a treatment period of 8 weeks.Ten days later we attempted to re-activate the follicles in the other ovary with the administration of FSH and hCG.The same parameters were examined in the right ovary. Measurements include histological analysis,hormone assay and Immunoblot analysis. Outcomes:significantly,more primordial and less atretic follicles were observed in the Everolimus plus Verapamil group.Immunoblot analysis revealed that the administration of Everolimus led to a significant reduction in the mTORC1.The expression of the anti-apoptotic molecule Bcl2 as well as of LC3-II and ATG12 was increased after removal of the Everolimus plus Verapamil combination,indicating reduced apoptosis and increased autophagy. Conclusions:The treatment with Everolimus and Verapamil can increase the number of primordial follicles while at the same time atresia is decreased. The purpose of the second study was to understand the impact of various pathways on the follicular growth. The current study was accomplished by analyzing articles relevant to POF.Medline searches were performed using various combinations of terms,such as POF,ovarian insufficiency,follicular development. In the third experimental study 40 female rats were divided into four groups.The combination of Progesterone and Estradiol was also used,to examine the effect on primordial follicles.Μeasurements include histological analysis,hormone assay and gene expression analysis.Outcomes:Progesterone significantly increases the number of primordial follicles.Estradiol alone decreased the number and the combination counterbalanced the effects of progesterone.Conclusions:The inhibition of follicular development through progesterone therapy can be counteracted by the simultaneous use of estradiol. The current doctoral thesis present histological and biochemical evidence that follicles can remain at the primordial stage and can be reactivated.This may help women wishing fertility preservation before chemotherapy or premature ovarian failure.

Η διατήρηση της αναπαραγωγικής ζωής μέσω αναστολή της διαδικασίας η οποία εξαντλεί το διαθέσιμο απόθεμα των ωοθυλακίων, αποτελεί σημαντική προϋπόθεση για τη διάρκεια της γονιμότητας. Η ανάδειξη των παθογενετικών μηχανισμών οι οποίοι εμπλέκονται στα στάδια ανάπτυξης του ωοθυλακίου αποτελεί το σπουδαιότερο παράγοντα και ως εκ τούτου το καίριο ερώτημα εάν μπορεί να επιτευχθεί η παύση των ωοθυλακίων και η εκ νέου ενεργοποίηση, αποτελεί το ζητούμενο αυτού του ερευνητικού έργου. Η αυξημένη απόπτωση και τελικά η εξάντληση του ωοθυλακικού αποθέματος αποτελεί κοινό χαρακτηριστικό της πρόωρης ωοθηκικής ανεπάρκειας και των ασθενών που λαμβάνουν αντικαρκινική θεραπεία. Ο έλεγχος της ανάπτυξης του ωοθυλακίου μέσω της παύσης και της εκ νέου ενεργοποίησης συνεισφέρει σημαντικά στην κατανόηση αυτής της εξελικτικής πορείας. Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής είναι η εξέταση της υπόθεσης κατά πόσο η αναστολή των αρχέγονων ωοθυλακίων και η επακόλουθη ενεργοποίησή τους μπορεί να επιτευχθεί με την παροδική αναστολή του mTOR.Διενεργήθηκαν τρεις μελέτες, μια πειραματική μελέτη για την αναστολή της ωοθυλακικής ανάπτυξης μέσω θεραπείας με Everolimus και Verapamil,μια συστηματική ανασκόπιση των μονοπατιών που εμπλέκονται στην ΠΩΑ και μια προκλινική μελέτη για τη θεραπεία με προγεστερόνη ή οιστραδιόλη ή συνδυασμό αυτών στη διατήρηση των αρχέγονων ωοθυλακίων. Μέθοδος: Στην πρώτη έρευνα σαράντα πέντε θηλυκοί μύες διαιρέθηκαν τυχαία σε πέντε ομάδες. Οι ομάδες έλαβαν everοlimus, everolimus + Verapamil, Everolimus+Fisetin και Fisetin μεμονωμένα. Τα αποτελέσματα μετρήθηκαν στην αριστερή ωοθήκη μετά από θεραπεία οκτώ εβδομάδων. Δέκα ημέρες αργότερα επιχειρήθηκε επανενεργοποίηση της ωοθηκικής λειτουργίας με τη χορήγηση FSH και hCG. Οι ίδιες παράμετροι εξετάστηκαν και στην δεξιά ωοθήκη με τις μετρήσεις να περιλαμβάνουν ιστολογική ανάλυση, ορμονικό έλεγχο και ανοσoαποτύπωση.Αποτελέσματα: Παρατηρούνται σημαντικά περισσότερα αρχέγονα και λιγότερα άτρητα ωοθυλάκια στην ομάδα Everolimus και Verapamil.Η ανάλυση ανοσοαποτύπωσης έδειξε ότι η χορήγηση Everolimus οδηγεί σε σημαντική μείωση του mTORC1.Η έκφραση του αντιαποπτωτικού μορίου Bcl2 καθώς και ο LC3-II και ο ATG12 αυξήθηκαν μετά την απόσυρση του συνδυασμού Everolimus και Verapamil επισημαίνοντας τη μείωση της απόπτωσης και την αύξηση της αυτοφαγίας. Συμπέρασμα: Η θεραπεία με Everolimus και Verapamil μπορεί να αυξήσει την κατακράτηση των αρχέγονων ωοθυλακίων και ταυτόχρονα να επιφέρει μείωση της ατρησίας. Ο σκοπός της δεύτερης έρευνας είναι η κατανόηση της επίδρασης των διαφόρων μονοπατιών επί της ωοθυλακικής ανάπτυξης αναλύοντας άρθρα σχετικά με την POF.Διενεργήθηκε αναζήτηση στη βάση Medline με όρους όπως:POF,POI,ωοθυλακική ανάπτυξη. Στην τρίτη πειραματική μελέτη σαράντα θηλυκοί μύες διαιρέθηκαν σε τέσσερις ομάδες. Χρησιμοποιήθηκε μεμονωμένα και συνδυαστικά προγεστερόνη και οιστραδιόλη για να εξεταστεί η δράση αυτών, στα αρχέγονα ωοθυλάκια. Οι μετρήσεις περιλαμβάνουν ιστολογική ανάλυση, ορμονικό έλεγχο και ανάλυση γονιδιακής έκφρασης. Αποτέλεσμα: Η προγεστερόνη αυξάνει σημαντικά τον αριθμό των αρχέγονων ωοθυλακίων, η οιστραδιόλη τον μειώνει, ενώ συνδυαστικά η οιστραδιόλη δρα ως αντενέργεια στην προγεστερόνη. Συμπέρασμα: η οιστραδιόλη δρα ως αντενέργεια στην αναστολή της ανάπτυξης των αρχέγονων ωοθυλακίων μέσω της χρήσης προγεστερόνης. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή παρουσιάζονται ιστολογικές και βιοχημικές αποδείξεις ότι τα ωοθυλάκια δύναται να παραμείνουν σε αρχέγονο στάδιο και μπορεί να επανενεργοποιηθούν. Το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να συμβάλει στη διατήρηση της γονιμότητας σε γυναίκες πριν από χημειοθεραπεία ή σε περίπτωση ΠΩΑ.