Μελέτη πολυστρωματικών διατάξεων πολυσακχαρίτη/πρωτεΐνης σε διεπιφάνειες

Abstract

The second half of the twentieth century saw an increasing growth of polymer science, on the one hand, and biology on the other. The invention of synthetic polymers and the massive growth of the plastics industry were accompanied by a parallel growth of polymer physics as a subject focused on synthetic rather than natural polymers, while the discovery of the genetic code and the development of protein crystallography led to a new discipline of molecular biology, whose research programme, pursued with spectacular success and intellectual confidence, concerned itself with rather different issues. Nonetheless, in the picture of life at the molecular level that has emerged from modern biology, we recognize many of the themes of soft matter. Apart from water, the major material components are macromolecular. Systems are dominated by weak, non-covalent interactions, and the fluctuations of Brownian motion are ever present. The formation of the structures necessary for biological function relies on self-assembly processes at both molecular and supramolecular levels. Ultimately, we should be able to hope to understand cell biology in terms of the concepts of soft matter physics. Proteins and polysaccharides are considered polymeric molecules that play a key role as components of life. Proteins are biopolymers that are considered sequenced copolymers of monomers called amino acids. Polymerisation of amino acids leads to a backbone of carbon atoms linked by covalent bonds (peptide bonds). Proteins, together with membranes, provide most of the hardware of cells, with three key functions. Enzymes are proteins that function as catalysts, facilitating all the chemical reactions that the cell needs to process energy and synthesise its component molecules (including proteins themselves). Proteins also serve as important structural elements, both within the cell and in the extra-cellular parts of tissues. Finally, combining their catalytic and structural roles they form the components of molecular machines which, for example, can convert chemical energy to mechanical energy both to transport materials around a cell and to give an organism motility. Polysaccharides are polymers of various sugars. Unlike nucleic acids or proteins their monomer units do not have a regular sequence; instead they are better thought of as random copolymers. They are used as stores of energy (e.g. starch in plants), and as structural elements (e.g. the cellulose of plant cells). Within the framework of the present dissertation, the physicochemical properties and the interactions of two pairs of biopolymers were experimentally investigated at a solid/fluid interface. The perspective of utilizing protein/polysaccharide complexes in multilayered thin films is demonstrated through the layer-by-layer (LbL) assembly method. More specifically, the components under study are the protein lysozyme with the polysaccharide xanthan gum (as the 1st pair) as well as the protein fibrinogen with the polysaccharide chitosan (as the 2nd pair). The LbL method is based on alternating sequential adsorption of two distinct components on a surface. The components utilized more often are polycations and polyanions while an important advantage provided within the framework of this method is the capability of controlling the thickness, structure and morphology of a film which exhibits tuned physicochemical properties in comparison to each single macromolecule. The experimental techniques involved in the study are the following: 1. Measurement of wettability properties (contact angle, surface tension) through the method; Shape Analysis of sessile drop profile - Contact Angle measurements 2. Quartz Crystal Microbalance 3. Attenuated Total Reflection-Fourier Transform Infrared Spectroscopy 4. Surface Plasmon Resonance Spectroscopy 5. Atomic Force Microscopy The prepared layers of xanthan/lysozyme assemblies are found stable in time in contact with the aqueous media and the measurements showed enhancement of the adsorbed amounts by an order of magnitude in comparison to the adsorption of the pure polysaccharide (10 mg•m-2 and 1 mg•m-2 respectively). In addition, the time for the formation of the multilayer was roughly 10 times shorter than the one of the pure polysaccharide (120 min and 1500 min respectively). The developed chitosan/fibrinogen multilayers were exploited by the Institute of Biology of Sorbonne University in order to further investigate the adhesion and spreading of cardiomyocytes. The viability and morphology of cardiomyocytes on protein/polysaccharide multilayers with high concentration (1 mg•ml-1) is superior compared with current used interfaces. This work demonstrates that the combination of proteins with polysaccharides in LbL multilayers is a promising methodology for biocompatible and multifunctional interfaces.

Κατά τον περασμένο αιώνα και ιδιαίτερα στο δεύτερο μισό, υπήρξε μια ραγδαία ανάπτυξη τόσο της επιστήμης των πολυμερών από τη μια πλευρά όσο και της βιολογίας από την άλλη. Η εφεύρεση των συνθετικών πολυμερών και η ανάπτυξη της βιομηχανίας των πλαστικών με την ταυτόχρονη ανάπτυξη της φυσικοχημείας των πολυμερών, εστίασε το ενδιαφέρον κυρίως στα συνθετικά αντί για τα φυσικά πολυμερή. Την ίδια περίοδο, η αποκρυπτογράφηση του γενετικού κώδικα και η ανάπτυξη της κρυσταλλογραφίας των πρωτεϊνών οδήγησε το ερευνητικό ενδιαφέρον της μοριακής βιολογίας σε διαφορετικά πεδία από αυτά των πολυμερών. Πάραυτα, με την απεικόνιση της ζωής σε μοριακό επίπεδο όπως αυτή ανέκυψε από τη μοριακή βιολογία, μπορούμε στη σύγχρονη εποχή να αναγνωρίζουμε πολλά θέματα βιολογικού υποβάθρου που σχετίζονται με το ερευνητικό πεδίο της χαλαρής ύλης. Πλην του νερού, τα σημαντικότερα συστατικά των έμβιων όντων είναι μακρομόρια. Τα συστήματα αυτά διέπονται από ασθενείς, μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις, στα οποία οι διακυμάνσεις της κίνησης Brown είναι παρούσες. Ο σχηματισμός των απαραίτητων δομών για τη βιολογική λειτουργία βασίζεται σε διαδικασίες αυτο-οργάνωσης τόσο σε μοριακό όσο και σε υπερ-μοριακό επίπεδο. Σε αυτή τη βάση, η κατανόηση της βιολογίας με όρους και αρχές της χαλαρής ύλης θεωρείται ως μια σύγχρονη πρόκληση με μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον. Στις μοριακές συνιστώσες της ζωής με σημαντικό ρόλο συγκαταλέγονται οι πρωτεΐνες και οι πολυσακχαρίτες. Οι πρωτεΐνες είναι βιολογικά μακρομόρια και αποτελούνται από δομικές μονάδες μονομερών τα αμινοξέα. Ο πολυμερισμός των αμινοξέων έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία μιας κεντρικής ανθρακικής αλυσίδας στην οποία τα μονομερή συγκρατούνται μέσω ομοιοπολικών δεσμών (πεπτιδικοί δεσμοί). Οι πρωτεΐνες μαζί με την κυτταρική μεμβράνη αποτελούν το μεγαλύτερο δομικό συστατικό των κυττάρων και επιτελούν τρεις βασικές λειτουργίες. Τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες που λειτουργούν ως καταλύτες διάφορων χημικών αντιδράσεων απαραίτητων για τη λειτουργία των κυττάρων. Επίσης, οι πρωτεΐνες αποτελούν δομικά στοιχεία τόσο της ενδοκυτταρικής οργάνωσης όσο και των ιστών των ζωντανών οργανισμών. Περαιτέρω συνδυάζοντας το δομικό και καταλυτικό τους ρόλο συμμετέχουν σε μοριακούς μηχανισμούς που μετατρέπουν τη χημική ενέργεια σε κινητική και συνεισφέρουν στη μεταφορά διαφορετικών συστατικών μεταξύ των κυττάρων. Οι πολυσακχαρίτες είναι οργανικά μακρομόρια διάφορων σακχάρων, τα οποία λογίζονται ως τυχαία συμπολυμερή (random copolymers), καθότι δεν υφίσταται μια συγκεκριμένη αλληλουχία μονομερών στην αλυσίδα τους. Οι κυριότερες λειτουργίες τους είναι η χρήση τους ως ενεργειακές αποθήκες (άμυλο), αλλά και η συμμετοχή τους ως δομικά συστατικά (κυτταρίνη φυτικών κυττάρων). Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μελετήθηκαν πειραματικά οι φυσικοχημικές ιδιότητες και οι αλληλεπιδράσεις για δύο ζεύγη μακρομορίων βιολογικού ενδιαφέροντος στη διεπιφάνεια στερεού-ρευστού, υπό το πρίσμα της τεχνικής συγκρότησης υμενίων Layer-by-Layer (LbL). Ειδικότερα, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης λυσοζύμης (lysozyme) με τον πολυσακχαρίτη ξανθάνη (xanthan gum) (ως το 1ο ζεύγος) και της πρωτεΐνης ινωδογόνο (fibrinogen) με τον πολυσακχαρίτη χιτοζάνη (chitosan) (ως το 2ο ζεύγος). Η LbL τεχνική συνίσταται στη διαδοχική προσρόφηση εναλλασσόμενων συστατικών σε μια επιφάνεια. Η ανάπτυξη ενός τέτοιου σύνθετου υμενίου (πάχος, σύσταση, τρισδιάστατη δομή) εμφανίζει συχνά διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες σε σχέση με τα αντίστοιχα μεμονωμένα μακρομόρια. Oι πειραματικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται είναι οι εξής: 1. Προσδιορισμός ιδιοτήτων διαβροχής (γωνία επαφής, επιφανειακή τάση) μέσω της μεθόδου ανάλυσης του προφίλ σταγόνας 2. Μικροζυγός Κρυστάλλου Χαλαζία 3. Φασματοσκοπία αποσβενύμενης ολικής ανάκλασης υπερύθρου 4. Φασματοσκοπία Επιφανειακών Πλασμονίων 5. Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης Τα υμένια ξανθάνης/λυσοζύμης εμφανίζουν σταθερότητα σε σχέση με το χρόνο κατά την επαφή με υδατικά διαλύματα και οι μετρήσεις υποδεικνύουν αύξηση της προσροφημένης ποσότητας κατά μία τάξη μεγέθους σε σχέση με την προσρόφηση του καθαρού πολυσακχαρίτη (10 mg•m-2 και 1 mg•m-2 αντίστοιχα). Επιπρόσθετα, ο χρόνος για τον σχηματισμό του υμενίου ήταν περίπου 10 φορές μικρότερος σε σχέση με την προσρόφηση του πολυσακχαρίτη (120 min και 1500 min αντίστοιχα). Τα υμένια χιτοζάνης/ινωδογόνου αξιοποιήθηκαν, μέσω συνεργασίας, από το Ινστιτούτο Βιολογίας του Πανεπιστημίου της Σορβόννης για την περαιτέρω διερεύνηση της πρόσφυσης και ανάπτυξης μυϊκών καρδιακών κυττάρων. Η βιωσιμότητα και η μορφολογία των κυττάρων, για το δείγμα υψηλής συγκέντρωσης (1 mg•ml-1), υπερέχει σε σχέση με τις υφιστάμενες διεπιφάνειες κυτταρικών καλλιεργειών. Η τρέχουσα διατριβή αναδεικνύει την προοπτική αξιοποίησης του συνδυασμού πρωτεϊνών και πολυσακχαριτών, υπό τη μέθοδο LbL, για την ανάπτυξη βιοσυμβατών και πολυ-λειτουργικών διεπιφανειών.