Η εξέλιξη των γονιδίων πρωτεολυτικών ενζύμων σε μεσογειακά είδη ιχθύων: συγκριτική γονιδιωματική και γενετική ανάλυση

Abstract

Proteolysis is a universal and fundamental biological process, critical for maintaining cellular homeostasis and regulating various biological functions across the domains of life. This complex mechanism involves the enzymatic hydrolysis of peptide bonds, resulting in the breakdown of proteins into smaller peptides and amino acids. The proteolytic systems have evolved into highly regulated mechanisms that coordinate the dynamic balance between protein degradation and synthesis, which is essential for proper cellular function and tissue remodeling. This thesis investigates the evolutionary trajectories of the genes encoding for the proteolytic enzymes calpains, cathepsins, and matrix metalloproteinases (MMPs), their gene architecture and expression. It focuses on the evolutionary dynamics of these protease genes in the teleost fish gilthead seabream (Sparus aurata) and European sea bass (Dicentrarchus labrax), following genome duplication events. The study aims to understand how these duplication events have influenced the diversification, functionality, and regulatory mechanisms of these enzymes in these species. Results, indicate that genome duplication events, especially the teleost-specific whole-genome duplication (TS-WGD), have played a significant role in the evolutionary trajectory of these genes. Phylogenetic and synteny analyses, along with protein structure modelling revealed that the duplications had an impact, shaping these gene families in a species-specific way. The study identified conserved and divergent functional mechanisms, distinguishing species-specific traits from universal processes. A detailed examination of gene origins showed that 12 gene families (capn11, capn14, capn2, capn3, capns1, capn15, capn5, capn6, ctsh, ctss, ctsz, and mmp11) derived from the TS-WGD, while six genes (capn2, capn8, ctsd, ctsb, ctsz, and mmp13) were retained from the earlier 1R-2R duplications. Additionally, specific single lineage duplications were identified to have occurred following the major WGD events. Subsequent analyses indicated that the paralogs of calpains, cathepsins, and matrix metalloproteinases in both gilthead seabream and European sea bass are functionally active and expressed, though they are differentially expressed. The different expression patterns, alongside the preservation of protein structure in the paralogs, suggest that the most likely evolutionary fate of these paralogs is regulatory sub-functionalization, with spatiotemporal differences in gene expression observed among adult tissues and developmental stages. Interestingly, this thesis established missense SNPs within the coding regions of calpains, cathepsins and metalloproteases associated with variations in enzymatic activity. This has led to the development of a genotyping tool aimed at producing fish with lower proteolytic activity, thereby extending the commercial shelf-life of fish fillets by reducing the rate of protein degradation.

Η πρωτεόλυση είναι μια καθολική και θεμελιώδης βιολογική διεργασία, κρίσιμη για τη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης και τη ρύθμιση διαφόρων βιολογικών λειτουργιών σε όλους τους οργανισμούς. Αυτός ο πολύπλοκος μηχανισμός περιλαμβάνει την ενζυμική υδρόλυση πεπτιδικών δεσμών, με αποτέλεσμα τη διάσπαση των πρωτεϊνών σε μικρότερα πεπτίδια και αμινοξέα. Τα πρωτεολυτικά συστήματα έχουν εξελιχθεί σε μηχανισμούς με αυστηρή ρύθμιση και συντονίζουν τη δυναμική ισορροπία μεταξύ της αποικοδόμησης και της σύνθεσης πρωτεϊνών, η οποία είναι απαραίτητη για τη σωστή κυτταρική λειτουργία και την αναδιαμόρφωση των ιστών. Η παρούσα διατριβή διερευνά την εξελικτική πορεία των των καλπαϊνών, των καθεψινών και των μεταλλοπρωτεασών εξωκυττάριου χώρου (MMPs), τη γονιδιακή τους αρχιτεκτονική και τα πρότυπα έκφρασής τους. Επικεντρώνεται στην εξελικτική δυναμική αυτών των πρωτεασών στην τσιπούρα (Sparus aurata) και στο λαβράκι (Dicentrarchus labrax), υπό το πρίσμα των γεγονότων διπλασιασμού ολόκληρου του γονιδιώματος. Η μελέτη αποσκοπεί στην κατανόηση του τρόπου με τον οποίο αυτά τα γεγονότα διπλασιασμού επηρέασαν τη διαφοροποίηση, τη λειτουργία και τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς αυτών των ενζύμων στα συγκεκριμένα είδη. Τα αποτελέσματα, δείχνουν ότι τα γεγονότα διπλασιασμού του γονιδιώματος, ιδίως ο ειδικός για τους τελεόστεους, διπλασιασμός ολόκληρου του γονιδιώματος (TS-WGD), έχουν διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην εξελικτική πορεία αυτών των γονιδίων. Οι αναλύσεις φυλογενετικής και συνταινικότητας, μαζί με την in silico ανάλυση της δομής των πρωτεϊνών αποκάλυψαν ότι οι διπλασιασμοί διαμόρφωσαν αυτές τις οικογένειες γονιδίων. Επιπρόσθετα, εντοπίστηκαν συντηρημένοι και αποκλίνοντες λειτουργικοί μηχανισμοί διαχωρίζοντας τις καθολικές από τις ειδικές, για κάθε είδος, διεργασίες. Η λεπτομερής εξέταση της εξελικτικής τροχιάς των καλπαϊνών, των καθεψινών και των μεταλλοπρωτεασών εξωκυττάριου χώρου (MMPs), έδειξε ότι 12 οικογένειες γονιδίων (capn11, capn14, capn2, capn3, capns1, capn15, capn5, capn6, ctsh, ctss, ctsz και mmp11) προήλθαν από τον TS-WGD, ενώ έξι γονίδια (capn2, capn8, ctsd, ctsb, ctsz και mmp13) διατηρήθηκαν από προηγούμενους διπλασιασμούς των σπονδυλωτών (1R-2R). Ακόμη, εντοπίστηκαν ειδικοί για τη γενεαλογία της τσιπούρας, διπλασιασμοί, οι οποίοι προέκυψαν μετά τα κύρια γεγονότα WGD. Όπως προέκυψε από αναλύσεις έκφρασης, τα παράλογα των καλπαϊνών, των καθεψινών και των μεταλλοπρωτεασών εξωκυττάριου χώρου τόσο στην τσιπούρα όσο και στο λαβράκι μεταγράφονται, παρόλο που παρουσιάζουν ρυθμιστική ή/και λειτουργική διαφοροποίηση μεταξύ τους. Τα διαφορετικά πρότυπα έκφρασης, σε συνδυασμό με τη διατήρηση της πρωτεϊνικής δομής στα παράλογα, υποδηλώνουν ότι η πιθανότερη εξελικτική μοίρα αυτών των παραλόγων είναι ο ρυθμιστικός επιμερισμός της λειτουργίας τους. Επιπλέον, η παρούσα διατριβή ανέδειξε μη συνώνυμους πολυμορφισμούς, οι οποίοι εδράζουν εντός των κωδικών περιοχών των καλπαϊνών, των καθεψινών και των MMPs και συσχετίστηκαν με διαφοροποιήσεις στην δραστηριότητα αυτών των ενζύμων μετά την αλίευση (βιοχημικός φαινότυπος). Αυτό οδήγησε στην ανάπτυξη ενός εργαλείου γονοτύπησης με στόχο την παραγωγή ιχθύων με χαμηλότερη πρωτεολυτική δραστικότητα, παρατείνοντας έτσι τον εμπορικό χρόνο ζωής των φιλέτων ιχθύων μέσω της μείωσης του ρυθμού αποικοδόμησης των πρωτεϊνών.