Παραγωγή μίκρο/νάνο-γαλακτωμάτων με βάση το ελαιόλαδο και μελέτη των ιδιοτήτων τους

Abstract

Micro/nano-emulsions are of particular interest in the food, supplement and pharmaceutical industries. Due to their small particle size, they can act as delivery systems of bioactive ingredients with high optical clarity, good kinetic stability and high bioavailability. However, achieving such a sufficiently stable structure against kinetic destabilization and oxidation makes it a challenge when formulating a structured emulsion. Water-in-oil (w/o) emulsions generally exhibit low stability due to the high mobility of water droplets, which can easily precipitate, flocculate or coalesce. Recent studies have confirmed that certain polyphenols contained naturally in olive oil affect both the kinetic and the oxidative stability of olive oil emulsified w/o systems. Their effectiveness in prolonging both the oxidative and colloidal stability of emulsions has been related to their surface-active properties and their ability to accumulate at the water/oil interface. However, there are very limited studies so far investigating the relationship between antioxidant activity and surfactant properties of these compounds in both model and real emulsion systems. The purpose of this thesis was to investigate the conditions for obtaining micro/nano-emulsions based on olive oil, as well as the effect of incorporating olive oil phenolic compounds of olive oil into them, seeking to investigate and reproduce the colloidal formations that are naturally contained in the recently produced virgin olive oil. Initially, the homogenization/preparation techniques and conditions that can lead to the preparation of micro/nano-emulsion with desired characteristics were investigated. Two micro/nano-emulsion preparation techniques were chosen at two exposure times (10 or 20 min): homogenization using a high-speed homogenizer at various rotation speeds (8000rpm, 10000rpm, 12000rpm), and homogenization using high-power ultrasound (150, 225, 300W). Tests showed that high-speed homogenization was more effective than ultrasonic homogenization. Despite the smaller mean droplet diameter achieved with ultrasound (45.6 nm compared to 114.4 nm with high speed), the use of ultrasound showed a high degree of polydispersity, negatively affecting the Emulsion Stability Index - ESI, (ESI%= 96-100 %, in contrast to high-speed homogenization ESI%=99-100%). The polydispersity index (PDI) with sonication was about 6 times higher than high speed homogenization. The turbidity and color of the emulsions varied accordingly with the PDI. The high-speed homogenization method at 12,000 rpm for 20 min was considered the best option for further investigation. Subsequently, a study was carried out to achieve w/o micro/nano-emulsion systems, based on refined olive oil, without the addition of a co-surfactant, but using food grade non-ionic emulsifiers (Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Span 20 and Span 80). This was followed by the construction of ternary phase diagrams with predetermined concentrations of emulsifier. Tests were carried out with the controlled addition of water to an oil-emulsifier mixture (titration) to determine the range of proportions of the three components that, by mixing them, can yield a micro/nano-emulsion. From this study it initially emerged that it is possible to prepare stable micro/nano-emulsions based on refined olive oil without the addition of a co-surfactant. In particular, Span 20 emulsifier was shown to have the most effective emulsifying capacity - addition of 27.3% w/w of this resulted in homogenization of 8.39% w/w water. Then, micro/nano-emulsions were prepared with specific emulsifier ratios (2%, 4%, 6%, 8% and 10% w/w) and 2% w/w aqueous phase ratio. 2% and 4% w/w Span 20 and Tween 20 ratios demonstrated 100% stability. The emulsifiers Tween 20, Tween 40 and Span 20 had the lowest Mean Droplet Diameter (MDD) values, with Tween 40 achieving the lowest MDD (45 nm at 6% w/w). Most emulsifiers showed low PDI (0.1-10.2). Micro/nano-emulsions prepared with Span 20 and Tween 60 had higher viscosity. Regarding the oxidative stability of the emulsions, it was shown that Span 80 showed the best protective effect, followed by Tween 80. Specifically, the Peroxide Value (PV) in (meqO2 kg-1) at the end of the observation period was 20.25 and 20.52 respectively for a 10% w/w emulsifier ratio in contrast to the blank which gave an PV value in (meqO2 kg-1) of 32.84 at the same conditions. Then, based on the most effective emulsifiers (Tween 20 and Span 20), the incorporation of the phenolic olive oil compounds (quercetin, apigenin, trans-cinnamic acid, and gallic acid in the aqueous phase at a ratio of 1% w/w) was studied, as well as their effect on the micro/nano-emulsions properties. As in the previous series of experiments, pseudo-ternary phase diagrams were constructed, and subsequently the kinetic and oxidative stability as well as the physicochemical properties of the micro/nano-emulsions were determined. It was concluded that all tested phenolic compounds except quercetin improved the quality characteristics of the emulsions. Specifically, in the emulsions containing gallic acid, the maximum aqueous phase concentration achieved in the prepared micro/nano-emulsions was 8.99 % w/w with the addition of 30.1% w/w Span 20, and 8.82 % w/w with the addition of 34.8% w/w Tween 20. The addition of the remaining phenolic compounds in combination with the emulsifiers Tween 20 and Span 20 had no significant effect on the phase diagrams of the studied systems. This study was followed by the preparation of micro/nano-emulsions with known proportions of water (2% w/w final emulsion) and emulsifier (0, 2, 4, 6, 8 and 10% w/w final emulsion) for each endogenous component. Gallic acid, apigenin and trans-cinnamic acid functioned synergistically with Tween 20 and Span 20 emulsifiers, extending their kinetic stability while improving their properties. The efficacy of phenolic olive oil compounds was: gallic acid (LogP = 0.7) > trans-cinnamic acid (LogP = 1.59) > apigenin (LogP = 2.1) > quercetin (LogP = 1.81). This ranking agrees with the order of their partition coefficient (LogP), except in the case of quercetin, leading to the conclusion that the amphiphilic nature of these compounds led them to be placed at the droplet interface and stabilize the emulsion. Quercetin due to its extremely low solubility in water was not considered effective and the micro/nano-emulsions in which it was incorporated showed low stability, high turbidity and mean droplet diameter values. Regarding the ESI index, better stability was achieved by the combination of the emulsifier Tween 20 at a ratio of 4% and 5% w/w and gallic acid incorporated in the aqueous phase. The lowest Mean Droplet Diameter (MDD) value achieved was 39.7 nm with the addition of 8% w/w Span 20 and gallic acid in the aqueous phase. Successively, a study was carried out on the preparation of micro/nano-emulsions using the emulsifier Tween 20 (0, 2, 4, and 6% w/w final emulsion), water ratio (2% w/w final emulsion) and as a continuous phase extra virgin olive oil or refined olive oil. The aim was to investigate the effect of the oil phase on the stability and properties of micro/nano-emulsions. The study showed that the prepared micro/nano-emulsions based on extra virgin olive oil were significantly superior in kinetic stability, as well as in oxidative stability, to those prepared based on refined olive oil. This was probably due to the increased concentration of micro-compounds contained in the extra virgin olive oil, which was used as a base for the preparation of micro/nano-emulsion. More specifically, micro/nano-emulsions were prepared based on the two oils with the addition of an emulsifier Tween 20 (2 and 4% w/w) and an aqueous phase of 2% w/w. Micro/nano-emulsions based on extra virgin olive oil showed a higher stability index, especially at storage conditions of 40 °C. The minimum MDD value achieved was 99.2 nm with preparation conditions of 4% w/w Tween 20 and extra virgin olive oil as base, compared to 110.7 nm based on refined olive oil. In addition, extra virgin olive oil as a base resulted in lower PDI values of the micro/nano-emulsions, which is an indication of greater stability. The turbidity values also varried accordingly. Micro/nano-emulsions prepared with refined olive oil had a lower initial PV than those prepared with extra virgin olive oil. This is because refined olive oil, during the refining process, is released from most of the substances that contribute to the formation of Peroxide Value. However, although an oil with an initially higher number of peroxides would be expected to oxidize at a faster rate than an oil with a very low concentration of peroxides, it was observed that the oxidation of micro/nano-emulsions with extra virgin olive oil progressed at a slower rate than that of micro/nano-emulsions based on refined olive oil. As an example, the emulsion prepared with 4% w/w Tween 20 and extra virgin olive oil had a PV value in (meqO2 kg-1) of 12.3 at the beginning of the study and at the end of the observation time at 40°C, the value evolved to 17.4. Respectively, the emulsion prepared with 4% w/w Tween 20 and refined olive oil had a PV value in (meqO2 kg-1) of 4.8 at the beginning of the study and at the end of the observation time at 40°C, the value evolved to 12.7.Next, an extensive study of the kinetics and oxidative stability of micro/nano-emulsions based on refined and extra virgin olive oil with emulsifier Tween 20 (proportions of 0%, 2%, 4% and 6% w/w), ratio of aqueous phase 2% w/w and addition of olive oil phenolic compounds (gallic, vanillic and syringic acids at a ratio of 1% w/w in the aqueous phase) was performed, which was framed by determining the physicochemical properties of the prepared micro/nano-emulsions as well as the surface tension of the individual phases. It was found that the micro/nano-emulsions based on extra virgin olive oil containing 4% w/w Tween 20 showed similar or even superior characteristics to micro/nano-emulsions based on refined olive oil containing 6% w/w Tween 20. The incorporated phenolic compounds of olive oil had excellent surfactant properties, significantly increasing the ESI% of the micro/nano-emulsions. Specifically, vanillic acid proved to be the most effective, followed by gallic and syringic acid. Micro/nano-emulsions based on extra virgin olive oil and 6% w/w emulsifier showed higher MDD values than those with 4% w/w emulsifier. Vanillic acid again proved to be the most effective, followed by gallic and syringic acids (smaller MDD value with extra virgin olive oil, 4% Tween 20 w/w and incorporation of vanillic acid in the aqueous phase). The PDI values also varied accordingly. The addition of the phenolic olive oil compounds resulted in a significant reduction in turbidity, with vanillic acid being the most effective. The turbidity values ranged from 135 NTU to 2551 NTU and corresponded to the micro/nano-emulsion based on extra virgin olive oil with the addition of vanillic acid and the blank emulsion without the addition of emulsifier and phenolic component, respectively. Extra virgin olive oil showed a lower surface tension than refined olive oil, which facilitated emulsion preparation. Also, the addition of the emulsifier Tween 20, further reduced the surface tension of the two oils. The addition of the three phenolic compounds of olive oil also reduced the surface tension of the aqueous phase, which confirms their surfactant properties. Gallic acid reduced the surface tension of deionized water by 17.9%, vanillic acid by 18.4%, and syringic acid by 19.7%. From these results, one could expect that syringic acid would be the most effective in stabilizing micro/nano-emulsions compared to the other two phenolic acids examined. However, ESI%, MDD, PDI and turbidity measurements showed that vanillic acid was the most effective followed by gallic acid. The oxidative stability study in conditions of accelerated oxidation of the above emulsions showed that the rate of change of PV of micro/nano-emulsions based on extra virgin olive oil was significantly lower than the one of the corresponding micro/nano-emulsions based on refined olive oil, due to the antioxidant micro-compounds naturally contained in extra virgin olive oil. The addition of the olive oil phenolic compounds to the aqueous phase significantly reduced the rate of change of PV of the studied micro/nano-emulsions. Specifically, gallic acid (k (d-1) = 1.2714) proved to be the most effective, followed by syringic acid (k (d-1) = 1.3445) and then vanillic acid (k (d-1 )= 1.3813). The conclusions of the oxidative stability study based on PV were confirmed by the rapid oxidative stability technique using the Oxitest® reactor. As in the PV study, gallic acid (IP (h)= 14.87) proved to be the most effective antioxidant component followed by syringic acid (IP (h)= 14.43) and vanillic acid (IP (h)= 13.66). Finally, the micro/nano-emulsions were studied in terms of the concentration of Total Phenolic Components (TFP) in accelerated oxidation conditions and the results were expressed as mg of gallic acid/Kg of emulsion (mg GAE/kg). At the end of the observation period for the micro/nano-emulsions prepared with extra virgin olive oil, gallic acid (95.1 mg GAE/kg) emerged as the most effective against oxidation followed by syringic acid (77.2 mg GAE/kg) and vanillic acid (61.7 mg GAE/kg). These conclusions are in agreement with the results of the PV study, demonstrating the direct correlation between the concentration of phenolic components and the oxidation of the oil. Finally, based on the previous conclusions, a study was carried out to develop 2nd degree mathematical polynomial models, using Response Surface Methodology (RSM), to predict the properties of the final micro/nano-emulsion (MDD, PDI, turbidity and ESI) as a function of the levels of the independent variables (of the ratio of emulsifier:2%, 4%, 6% w/w emulsion and gallic acid: 0%, 0.5%, 1% w/w aqueous phase). The resulting equations were found to be statistically significant with the R2 correlation coefficient equal to 0.993, 0.968, 0.997 and 0.989 respectively. The properties of micro/nano-emulsions were significantly affected by the ratio of emulsifier and gallic acid. Increasing the emulsifier ratio led to improved micro/nano-emulsions properties up to a ratio of 6% w/w. In addition higher proportions of gallic acid led to an improvement in the properties of the micro/nano-emulsions, verifying the surfactant properties of gallic acid. The micro/nano-emulsion preparation combinations incorporating gallic acid that can lead to micro/nano-emulsions with the most desirable properties are: 3.14-4.45% w/w Tween 20 and 1% w/w gallic acid for MDD, 2.95-4.56% w/w Tween 20 and 1% w/w gallic acid for PDI, 2.35%-5.21% Tween 20 and 1% w/w gallic acid for turbidity and 3.21-5.25% w/w Tween 20 and 1% w/w gallic acid for ESI. The results of this research provide information for the design and preparation of optimized n/e micro/nano-emulsions, with integrated bioactive olive oil phenolic compounds characterized by high stability and desirable properties.

Τα μικρο/νανο-γαλακτώματα παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον στη βιομηχανία τροφίμων, συμπληρωμάτων και φαρμακευτικών προϊόντων. Λόγω του μικρού μεγέθους σωματιδίων τους μπορούν να οδηγήσουν σε συστήματα χορήγησης βιοδραστικών συστατικών με υψηλή οπτική διαύγεια, καλή κινητική σταθερότητα και υψηλή βιοδιαθεσιμότητα. Η επίτευξη όμως μίας τέτοιας επαρκώς σταθερής δομής έναντι της κινητικής αποσταθεροποίησης και της οξείδωσης καθιστά έναν στόχο/πρόκληση κατά τη διαμόρφωση ενός δομημένου γαλακτώματος. Τα γαλακτώματα τύπου νερό-σε-έλαιο (ν/ε) γενικώς παρουσιάζουν χαμηλή σταθερότητα λόγω της υψηλής κινητικότητας των σταγονιδίων νερού, τα οποία μπορούν εύκολα να κατακρημνιστούν, να κροκιδωθούν ή να συνενωθούν. Πρόσφατες μελέτες επιβεβαίωσαν ότι ορισμένες πολυφαινόλες που περιέχονται στο ελαιόλαδο επηρεάζουν τόσο τις ιδιότητες διασποράς όσο και την οξειδωτική σταθερότητα των γαλακτωματοποιημένων συστημάτων ελαιόλαδου ν/ε. Η αποτελεσματικότητά τους να παρατείνουν τόσο την οξειδωτική όσο και την κολλοειδή σταθερότητα των γαλακτωμάτων έχει συσχετιστεί με τις επιφανειακές τους ιδιότητες και την ικανότητά τους να συσσωρεύονται στη διεπιφάνεια νερού/ελαίου. Ωστόσο, λίγες είναι μέχρι τώρα οι μελέτες που διερευνούν τη σχέση μεταξύ της αντιοξειδωτικής δράσης και των επιφανειοδραστικών ιδιοτήτων αυτών των ενώσεων τόσο σε μοντέλα όσο και σε πραγματικά συστήματα γαλακτωμάτων. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση των ιδιαίτερων συνθηκών επίτευξης μικρο/νανο-γαλακτωμάτων ν/ε με βάση το ελαιόλαδο, καθώς και της δυνατότητας ενσωμάτωσης φαινολικών συστατικών του ελαιόλαδου σε αυτά, επιδιώκοντας ταυτόχρονα τη διερεύνηση και την αναπαραγωγή των κολλοειδών σχηματισμών που από τη φύση του περιέχει το παρθένο ελαιόλαδο πρόσφατης παραγωγής. Αρχικά διερευνήθηκαν οι τεχνικές και οι συνθήκες ομογενοποίησης/παρασκευής που μπορούν να οδηγήσουν στην παρασκευή μικρο/νανο-γαλακτώματος με επιθυμητά χαρακτηριστικά. Επιλέχθηκαν δύο τεχνικές παρασκευής μικρο/νανο-γαλακτωμάτων σε δύο χρόνους έκθεσης (10 ή 20 min): ομογενοποίηση με χρήση ομογενοποιητή υψηλής ταχύτητας σε διάφορες ταχύτητες περιστροφής (8000 rpm, 10000 rpm, 12000 rpm), και ομογενοποίηση με χρήση υπερήχων υψηλής ισχύος (150, 225, 300 W). Οι δοκιμές έδειξαν ότι η ομογενοποίηση με υψηλή ταχύτητα ήταν αποτελεσματικότερη από την ομογενοποίηση με υπέρηχους. Παρά τη μικρότερη μέση διάμετρο των σταγονιδίων με υπέρηχους (45,6 nm σε σχέση με 114,4 nm με υψηλής ταχύτητα), η χρήση υπερήχων επέδειξε υψηλό βαθμό πολυδιασποράς, επηρεάζοντας αρνητικά το Δείκτη Σταθερότητας Γαλακτώματος - ESI, (ESI%= 96-100%, σε αντίθεση με την ομογενοποίηση με υψηλή ταχύτητα ESI%=99-100%). Ο δείκτης πολυδιασποράς (PDI) με υπέρηχους ήταν περίπου 6 φορές μεγαλύτερος από την ομογενοποίηση υψηλής ταχύτητας. Η θολότητα και το χρώμα των γαλακτωμάτων κυμάνθηκαν αντιστοίχως με τον PDI. Η τεχνική ομογενοποίησης με υψηλή ταχύτητα με 12.000 rpm για 20 min θεωρήθηκε η καλύτερη για περαιτέρω έρευνα. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη για επίτευξη συστημάτων ν/ε μικρο/νανο-γαλακτωμάτων, με βάση το εξευγενισμένο ελαιόλαδο, χωρίς προσθήκη συν-επιφανειοδραστικής ουσίας, αλλά με χρήση μη ιονικών γαλακτωματοποιητών, εγκεκριμένων για τη χρήση τους στην παραγωγή τροφίμων (Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Span 20 και Span 80). Ακολούθησε η κατασκευή τριαδικών διαγραμμάτων φάσης με προκαθορισμένες συγκεντρώσεις γαλακτωματοποιητή και πραγματοποιήθηκαν δοκιμές με ελεγχόμενη προσθήκη νερού σε μίγμα ελαίου-γαλακτωματοποιητή (τιτλοδότηση) με σκοπό να προσδιοριστεί το φάσμα των αναλογιών των τριών συστατικών που με ανάμιξή τους μπορούν να αποδώσουν μικρο/νανο-γαλάκτωμα. Από τη μελέτη αυτή προέκυψε αρχικά ότι είναι εφικτή η παρασκευή σταθερών μικρο/νανο-γαλακτωμάτων με βάση εξευγενισμένο ελαιόλαδο χωρίς την προσθήκη συν-επιφανειοδραστικής ουσίας. Συγκεκριμένα, ο γαλακτωματοποιητής Span 20 αποδείχθηκε ότι έχει την πιο αποτελεσματική γαλακτωματοποιητική ικανότητα - προσθήκη 27,3% w/w αυτού οδήγησε σε ομογενοποίηση 8,39% w/w νερού. Έπειτα, παρασκευάστηκαν μικρο/νανο-γαλακτώματα με συγκεκριμένες αναλογίες γαλακτωματοποιητή (2%, 4%, 6%, 8% και 10% w/w) και 2% w/w αναλογία υδατικής φάσης. Οι αναλογίες 2% και 4% w/w Span 20 και Tween 20 επέδειξαν 100% σταθερότητα. Οι γαλακτωματοποιητές Tween 20, Tween 40 και Span 20 είχαν τις χαμηλότερες Μέσες Τιμές Διαμέτρου Σταγονιδίων (MDD), με το Tween 40 να επιτυγχάνει τις μικρότερες MDD (45 nm σε 6% w/w). Οι περισσότεροι γαλακτωματοποιητές εμφάνισαν χαμηλό PDI (0,1-10,2). Τα μικρο/νανο-γαλακτώματα που παρασκευάστηκαν με Span 20 και Tween 60 είχαν υψηλότερο ιξώδες. Όσον αφορά στην οξειδωτική σταθερότητα των γαλακτωμάτων αποδείχθηκε ότι ο γαλακτωματοποιητής Span 80 είχε την καλύτερη προστατευτική δράση, ακολουθούμενος από τον Tween 80. Συγκεκριμένα ο Αριθμός Υπεροξειδίων (Α.Υ. σε meqO2 kg-1) στο τέλος της χρονικής διάρκειας παρατήρησης ήταν 20,25 και 20,52 αντίστοιχα για αναλογία γαλ/τή 10% w/w σε αντίθεση με το τυφλό δείγμα που έδωσε τιμή A.Y., 32,84 στον ίδιο χρόνο. Στη συνέχεια, με βάση τους αποτελεσματικότερους γαλακτωματοποιητές (Tween 20 και Span 20), μελετήθηκε η ενσωμάτωση των φαινολικών συστατικών του ελαιόλαδου: κερσετίνη, απιγενίνη, t-σινναμικό οξύ, και γαλλικό οξύ στην υδατική φάση σε αναλογία 1% w/w, καθώς και η επίδρασή τους στις ιδιότητες των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων. Όπως και στην προηγούμενη σειρά πειραμάτων, κατασκευάστηκαν ψευδο-τριαδικά διαγράμματα φάσης, και μελετήθηκε η κινητική και οξειδωτική σταθερότητα καθώς οι φυσικοχημικές ιδιότητες των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων σε προκαθορισμένες αναλογίες των τριών συστατικών. Προέκυψε ότι όλα τα συστατικά που δοκιμάστηκαν πλην της κερσετίνης, βελτίωσαν τα ποιοτικά χαρακτηριστικά των γαλακτωμάτων. Συγκεκριμένα, η μέγιστη συγκέντρωση υδατικής φάσης (1% w/w γαλλικό οξύ) που επιτεύχθηκε στα παρασκευασμένα μικρο/νανο-γαλακτώματα ήταν 8,99 % w/w με την προσθήκη 30,1% w/w Span 20, και 8,82% w/w με προσθήκη 34,8% w/w Tween 20. Η προσθήκη των υπόλοιπων φαινολικών συστατικών του ελαιόλαδου σε συνδυασμό με τους γαλακτωματοποιητές Tween 20 και Span 20 δεν είχε σημαντική επίδραση στα διαγράμματα φάσης των μελετώμενων συστημάτων. Ακολούθησε η παρασκευή μικρο/νανο-γαλακτωμάτων με γνωστές αναλογίες νερού (2% w/w τελικού γαλακτώματος) και γαλακτωματοποιητή (0, 2, 4, 6, 8 και 10% w/w τελικού γαλακτώματος) για κάθε φαινολικό συστατικό. Το γαλλικό οξύ, η απιγενίνη και το trans-σινναμικό οξύ λειτούργησαν συνεργιστικά με τους γαλακτωματοποιητές Tween 20 και Span 20, επιμηκύνοντας την κινητική σταθερότητά τους, βελτιώνοντας παράλληλα τις ιδιότητές τους. Η αποτελεσματικότητα των φαινολικών συστατικών του ελαιόλαδου ήταν: γαλλικό οξύ (LogP = 0.7)> trans-σινναμικό οξύ (LogP = 1.59) > απιγενίνη (LogP = 2.1)> κερσετίνη (LogP = 1.81). Η κατάταξη αυτή συμφωνεί με τη σειρά του συντελεστή κατανομής τους (LogP), εκτός από την περίπτωση της κερσετίνης, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι ο αμφιφιλικός χαρακτήρας των συστατικών αυτών τα οδήγησε να τοποθετηθούν στη διεπιφάνεια των σταγονιδίων και να σταθεροποιήσουν το γαλάκτωμα. Η κερσετίνη λόγω της εξαιρετικά χαμηλής διαλυτότητάς της στο νερό δεν κρίθηκε αποτελεσματική και τα μικρο/νανο-γαλακτώματα στο οποία ενσωματώθηκε παρουσίασαν χαμηλή σταθερότητα, υψηλή θολότητα και υψηλή μέση τιμή σταγονιδίων. Υψηλότερη σταθερότητα επέδειξε ο συνδυασμός του γαλακτωματοποιητή Tween 20 σε αναλογία 4% και 5% w/w και γαλλικού οξέος ενσωματωμένου στην υδατική φάση. Η μικρότερη τιμή MDD που επιτεύχθηκε ήταν 39,7 nm με προσθήκη 8 % w/w Span 20 και γαλλικού οξέος στην υδατική φάση. Όλα τα υπό εξέταση γαλακτώματα παρουσίασαν MDD<500nm, επομένως χαρακτηρίστηκαν ως μικρο/νανο-γαλακτώματα. Η προσθήκη των φαινολικών συστατικών του ελαιόλαδου μείωσε το δείκτη PDI και τη θολότητα των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων, με εξαίρεση την κερσετίνη. Οι βελτιωμένες αυτές ιδιότητες των μικρο/νανογαλακτωμάτων επαληθεύονται και από τις υψηλότερες απόλυτες τιμές ζ-δυναμικού που μετρήθηκαν στα γαλακτώματα που περιείχαν φαινολικά συστατικά του ελαιόλαδου. Η μελέτη οξείδωσης που πραγματοποιήθηκε απέδειξε τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες των τεσσάρων φαινολικών συστατικών του ελαιόλαδου, ενώ επιβεβαίωσε την προστατευτική δράση των γαλακτωματοποιητών στην οξείδωση των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων. Το γαλλικό οξύ αποδείχτηκε ότι είχε τις πιο ισχυρές αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε μελέτη παρασκευής μικρο/νανο-γαλακτωμάτων με χρήση του γαλακτωματοποιητή Tween 20 (0, 2, 4, και 6% w/w τελικού γαλακτώματος), αναλογία νερού (2% w/w τελικού γαλακτώματος) και βάση το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο ή το εξευγενισμένο ελαιόλαδο. Σκοπός ήταν να διερευνηθεί η επίδραση της φύσης του ελαίου στη σταθερότητα και στις ιδιότητες των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων. Από τη μελέτη προέκυψε ότι τα παρασκευασμένα μικρο/νανο-γαλακτώματα με χρήση εξαιρετικού παρθένου ελαιόλαδου υπερτερούν σημαντικά σε κινητική σταθερότητα, όσο και σε οξειδωτική σταθερότητα, εκείνων που παρασκευάστηκαν με βάση το εξευγενισμένο ελαιόλαδο. Αποδεικνύεται ότι αυτό οφείλεται στην αυξημένη συγκέντρωση των μικρο-συστατικών που περιέχονται στο εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως βάση παρασκευής μικρο/νανο-γαλακτώματος. Αποδείχτηκε ακόμη ότι τα μικρο-συστατικά αυτά έχουν επιφανειοδραστικές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες, οδηγώντας σε ανώτερα, πιο σταθερά μικρο/νανο-γαλακτώματα. Πιο συγκεκριμένα, παρασκευάστηκαν μικρο/νανο-γαλακτώματα με βάση τα δύο έλαια με προσθήκη γαλακτωματοποιητή Tween 20 (2 και 4% w/w) και υδατικής φάσης 2% w/w. Τα μικρο/νανο-γαλακτώματα με βάση το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο εμφάνισαν μεγαλύτερο δείκτη σταθερότητας, και ειδικότερα σε συνθήκες αποθήκευσης 40 °C. Η ελάχιστη τιμή MDD που επιτεύχθηκε ήταν 99,2 nm με συνθήκες παρασκευής 4% w/w Tween 20 και εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο ως βάση, σε σύγκριση με 110,7 nm με βάση το εξευγενισμένο ελαιόλαδο. Επιπλέον, το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο ως βάση οδήγησε σε χαμηλότερες τιμές PDI των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων, κάτι που αποτελεί ένδειξη μεγαλύτερης σταθερότητας. Αντίστοιχα κινήθηκαν και οι τιμές της θολότητας. Τα μικρο/νανο-γαλακτώματα που παρασκευάστηκαν με εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο είχαν μεγαλύτερο αρχικό Α.Υ. σε σχέση με εκείνα που παρασκευάστηκαν με εξευγενισμένο ελαιόλαδο. Παρόλα αυτά, αυτό οφείλεται στο ότι το εξευγενισμένο ελαιόλαδο, κατά τις διαδικασίες του εξευγενισμού, απαλλάσσεται από το μεγαλύτερο μέρος των ουσιών που συμβάλλουν στη διαμόρφωση του Αριθμού των Υπεροξειδίων. Ωστόσο, παρότι θα αναμενόταν ένα έλαιο με αρχικά υψηλότερο αριθμό υπεροξειδίων να οξειδωθεί με ταχύτερο ρυθμό απ’ ότι ένα έλαιο με πολύ χαμηλή συγκέντρωση υπεροξειδίων, παρατηρήθηκε ότι η οξείδωση των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων με εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο εξελίχθηκε με βραδύτερο ρυθμό σε σχέση με εκείνο των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων με βάση το εξευγενισμένο ελαιόλαδο. Ενδεικτικά, το γαλάκτωμα που παρασκευάστηκε με 4% w/w Tween 20 και εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο είχε τιμή Α.Υ. (meqO2 kg-1), 12,3 στην αρχή της μελέτης και στο τέλος του χρόνου παρατήρησης στους 40°C, η τιμή εξελίχθηκε σε 17,4. Αντίστοιχα, το γαλάκτωμα που παρασκευάστηκε με 4% w/w Tween 20 και εξευγενισμένο ελαιόλαδο είχε τιμή Α.Υ. (meqO2 kg-1), 4,8 στην αρχή της μελέτης και στο τέλος του χρόνου παρατήρησης στους 40°C, η τιμή εξελίχθηκε σε 12,7. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε εκτεταμένη μελέτη της κινητικής και οξειδωτικής σταθερότητας μικρο/νανο-γαλακτωμάτων με βάση τόσο το εξευγενισμένο όσο και το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο με γαλακτωματοποιητή Tween 20 (αναλογίες 0%, 2%, 4% και 6% w/w), αναλογία υδατικής φάσης 2% w/w και προσθήκη φαινολικών συστατικών του ελαιόλαδου (γαλλικό, βανιλικό και συριγγικό οξύ σε αναλογία 1% w/w στην υδατική φάση), που πλαισιώθηκε με προσδιορισμό των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των παρασκευαζόμενων μικρο/νανο-γαλακτωμάτων καθώς και της επιφανειακής τάσης των επιμέρους φάσεων. Προέκυψε ότι τα μικρο/νανο-γαλακτώματα με βάση εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο που περιείχαν 4% w/w Tween 20, εμφάνισαν παρόμοια ή και ανώτερα χαρακτηριστικά με τα μικρο/νανο-γαλακτώματα με βάση εξευγενισμένο ελαιόλαδο που περιείχαν 6% w/w Tween 20. Τα ενσωματωμένα φαινολικά συστατικά του ελαιόλαδου είχαν εξαιρετικές επιφανειοδραστικές ιδιότητες, αυξάνοντας σημαντικά το ESI% των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων. Συγκεκριμένα, το βανιλικό οξύ αποδείχθηκε το πιο αποτελεσματικό, ακολουθούμενο από το γαλλικό και το συριγγικό οξύ. Tα μικρο/νανο-γαλακτώματα με βάση το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο και γαλακτωματοποιητή 6% w/w παρουσίασαν μεγαλύτερες τιμές MDD από εκείνα με 4% w/w γαλακτωματοποιητή. Το βανιλικό οξύ και πάλι αποδείχτηκε το πιο αποτελεσματικό, ακολουθούμενο από το γαλλικό και το συριγγικό οξύ (μικρότερη τιμή MDD με εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο, 4% Tween 20 w/w και ενσωμάτωση του βανιλικού οξέος στην υδατική φάση). Αντίστοιχα κινήθηκε και η μεταβολή του δείκτη PDI. Η προσθήκη των φαινολικών συστατικών του ελαιόλαδου είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση της θολότητας, με το βανιλικό οξύ να είναι το πιο αποτελεσματικό. Οι τιμές της θολότητας κυμάνθηκαν από 135 NTU μέχρι 2551 NTU και αντιστοιχούσαν στο μικρο/νανο-γαλάκτωμα με βάση το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο με προσθήκη βανιλικού οξέος και στο τυφλό γαλάκτωμα χωρίς προσθήκη γαλακτωματοποιητή και φαινολικού συστατικού αντιστοίχως. Το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο είχε χαμηλότερη επιφανειακή τάση σε σχέση με το εξευγενισμένο ελαιόλαδο, γεγονός που διευκολύνει την παρασκευή γαλακτώματος. Επιπλέον, η προσθήκη του γαλακτωματοποιητή Tween 20, μείωσε περαιτέρω την επιφανειακή τάση των δύο ελαίων. Η προσθήκη των τριών φαινολικών συστατικών του ελαιόλαδου μείωσε επίσης την επιφανειακή τάση της υδατικής φάσης, το οποίο αποδεικνύει τις επιφανειοδραστικές τους ιδιότητες. Το γαλλικό οξύ μείωσε την επιφανειακή τάση του απιονισμένου νερού κατά 17,9%, το βανιλικό οξύ κατά 18,4% και το συριγγικό κατά 19,7%. Από τα αποτελέσματα αυτά και μόνο θα ήταν αναμενόμενο, το συριγγικό οξύ να είναι το πιο αποτελεσματικό στη σταθεροποίηση των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων σε σχέση με τα άλλα δύο εξεταζόμενα φαινολικά οξέα. Ωστόσο, οι προσδιορισμοί ESI%, MDD, PDI και θολότητας απέδειξαν ότι το βανιλικό και στη συνέχεια το γαλλικό οξύ ήταν τα πιο αποτελεσματικά. Η μελέτη οξειδωτικής σταθερότητας σε συνθήκες επιταχυμένης οξείδωσης των παραπάνω γαλακτωμάτων έδειξε ότι ο ρυθμός μεταβολής του Α.Υ. των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων με βάση το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο ήταν σημαντικά χαμηλότερος από εκείνον των αντίστοιχων μικρο/νανο-γαλακτωμάτων με βάση εξευγενισμένο ελαιόλαδο, τουλάχιστον για το διάστημα των πρώτων 10 ημερών λόγω του πλήθους αντιοξειδωτικών μικρο-συστατικών που περιέχονται φυσικά στο εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο. Η προσθήκη των φαινολικών συστατικών του ελαιόλαδου στην υδατική φάση μείωσε σημαντικά τη σταθερά ρυθμού μεταβολής Α.Υ. των μελετώμενων μικρο/νανο-γαλακτωμάτων. Συγκεκριμένα το γαλλικό οξύ (k (d-1)= 1,2714) αποδείχθηκε ως το πιο αποτελεσματικό, ακολουθούμενο από το συριγγικό (k (d-1)= 1,3445) και μετά από το βανιλικό οξύ (k (d-1)= 1,3813). Τα συμπεράσματα της μελέτης της οξειδωτικής σταθερότητας με βάση το Α.Υ. επιβεβαιώθηκαν από την τεχνική προσδιορισμού οξειδωτικής σταθερότητας με χρήση του αντιδραστήρα Oxitest®. Η ενσωμάτωση των τριών φαινολικών συστατικών του ελαιόλαδου επηρέασε σημαντικά την οξειδωτική σταθερότητα των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων. Όπως και στον προσδιορισμό Α.Υ., το γαλλικό οξύ (IP (h)= 14,87) αποδείχθηκε ως το πιο αποτελεσματικό αντιοξειδωτικό συστατικό ακολουθούμενο από το συριγγικό (IP (h)= 14,43) και το βανιλικό οξύ (IP (h)= 13,66). Τέλος τα μικρο/νανο-γαλακτώματα μελετήθηκαν ως προς τη συγκέντρωση των περιεχόμενων Ολικών Φαινολικών Συστατικών (Ο.Φ.Σ.) σε επιταχυμένες συνθήκες οξείδωσης και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως mg γαλλικού οξέος/kg γαλακτώματος (mg GAE/kg). Κατά το τέλος της χρονικής διάρκειας παρατήρησης για τα μικρο/νανο-γαλακτώματα που παρασκευάστηκαν με εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο, το γαλλικό οξύ (95,1 mg GAE/kg) προέκυψε ως το πιο προστατευτικό έναντι της οξείδωσης ακολουθούμενο από το συριγγικό (77,2 mg GAE/kg) και μετά από το βανιλικό οξύ (61,7 mg GAE/kg). Τα συμπεράσματα αυτά συμφωνούν με τα αποτελέσματα του προσδιορισμού μεταβολής του Α.Υ., αποδεικνύοντας την άμεση συσχέτιση μεταξύ συγκέντρωσης φαινολικών συστατικών και οξειδωσιμότητας του ελαίου. Τέλος, με βάση τα προηγούμενα συμπεράσματα, πραγματοποιήθηκε μία μελέτη εύρεσης μαθηματικών πολυωνυμικών μοντέλων 2ου βαθμού, με μεθοδολογία επιφανειών απόκρισης (RSM), για την πρόβλεψη των ιδιοτήτων του τελικού μικρο/νανο-γαλακτώματος (MDD, PDI, θολότητας και ESI) συναρτήσει των επιπέδων των ανεξάρτητων μεταβλητών (της αναλογίας γαλακτωματοποιητή:2%, 4%, 6% w/w γαλακτώματος και γαλλικού οξέος: 0%, 0,5%, 1% w/w υδατικής φάσης). Οι προκύπτουσες εξισώσεις αποδείχθηκαν στατιστικά σημαντικές με τον συντελεστή συσχέτισης R2 να ισούται με 0,993, 0,968, 0,997 και 0,989 αντιστοίχως. Οι ιδιότητες των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων επηρεάστηκαν σημαντικά από την αναλογία του γαλακτωματοποιητή και του γαλλικού οξέος. Η αύξηση της αναλογίας γαλακτωματοποιητή βελτίωσε τις ιδιότητες των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων έως την αναλογία των 6% w/w. Η αύξηση της αναλογίας του γαλλικού οξέος οδήγησε σε βελτίωση των ιδιοτήτων των μικρο/νανο-γαλακτωμάτων, επαληθεύοντας τις επιφανειοδραστικές ιδιότητες του γαλλικού οξέος. Οι συνδυασμοί παρασκευής μικρο/νανο-γαλακτωμάτων με ενσωμάτωση γαλλικού οξέος που μπορεί να οδηγήσουν σε μικρο/νανο-γαλακτώματα με τις πιο επιθυμητές ιδιότητες είναι: 3,14-4,45% w/w Tween 20 και 1% w/w γαλλικό οξύ για το MDD, 2,95-4,56% w/w Tween 20 και 1% w/w γαλλικό οξύ για το PDI, 2,35%-5,21% Tween 20 και 1% w/w γαλλικό οξύ για τη θολότητα και 3,21-5,25% w/w Tween 20 και 1% w/w γαλλικό οξύ για το ESI.Τα αποτελέσματα αυτής της έρευνας παρέχουν πληροφορίες για τον σχεδιασμό και την παρασκευή βελτιστοποιημένων μικρο/νανο-γαλακτωμάτων ν/ε, με ενσωματωμένα βιοδραστικά φαινολικά συστατικά του ελαιόλαδου χαρακτηριζόμενα από υψηλή σταθερότητα και επιθυμητές ιδιότητες.