Νανο-τεχνολογική προσέγγιση καρκινικών βιοδεικτών

Abstract

In this dissertation, studies were conducted to develop new nanotechnological methods for detecting cancer biomarkers (mainly the DJ-1 protein) with the aim of early disease diagnosis and monitoring patients during their therapeutic treatment. Additionally, efforts were made to better understand the oncogenic role of the DJ-1 protein and its relationship with the prognosis of various types of cancers. The study investigated how immunotherapy with immune checkpoint inhibitors could affect serum levels of DJ-1 protein of cancer patients and if the DJ-1 could be used as a new predictive and prognostic cancer biomarker using current achievements in nanotechnology. Finally, we studied the levels of Short-Chain Fatty Acids (SCFAs) in the serum of cancer patients receiving immunotherapy and how these affect treatment responses. For the quantitative determination of the oncogenic protein DJ-1 in serum samples of cancer patients, was used the Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) method, specifically the sub-method Sandwich ELISA. Statistical analysis of measurements was conducted based on various clinicopathological characteristics of patients and disease outcomes. Results between the classic ELISA method and Raman spectroscopy were compared, with Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) being a particularly useful tool for precise molecular identification. In particular, the effect of surface-enhanced Raman (SERS), which substantially enhances the sensitivity of conventional Raman spectroscopy, was used by instilling blood serum and pure DJ-1 protein on metallic nanostructured plasmonic surfaces. For the determination of short-chain fatty acids, the Liquid Chromatography coupled with Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) method was used (Liquid Chromatography /Tandem Mass Spectrometry). According to our results, DJ-1 protein could be used as a biomarker related to histological type (adenocarcinoma), primary site (gynecological cancer), some clinicopathological criteria, and PTEN. However, our study revealed no correlation between DJ-1 protein and the response to immunotherapy, requiring further research for its use as a predictive biomarker. Regarding Short-Chain Fatty Acids (SCFAs), only butyric acid showed a statistically significant increase in serum concentrations of cancer patients undergoing immunotherapy, with a significant change between two time points. This increase, however, was not correlated with the corresponding response to treatment. Similar results were observed for butyric acid in the subgroup of patients with lung cancer. Finally, Raman spectra analysis, using Silver-Based Plasmonic Nanoparticles, identified the fingerprint peak of the DJ-1 protein, and was noted a decrease in this peak after immunotherapy. In fact, the latter result absolutely matches with ELISA findings, thus making plasmonic substrates and SERS a promising method for bioanalysis and biosensing.

Στα πλαίσια της προκείμενης διδακτορικής εργασίας, πραγματοποιήθηκαν μελέτες με σκοπό την ανάπτυξη νέων νανο-τεχνολογικών μεθόδων ανίχνευσης καρκινικών βιο-δεικτών (κυρίως της πρωτεΐνης DJ-1) με σκοπό την έγκαιρη διάγνωση της νόσου και την παρακολούθηση ασθενών κατά την διάρκεια της θεραπευτικής τους αγωγής. Στα πλαίσια της περαιτέρω κατανόησης της πρωτεΐνης DJ-1 και της σχέσης της με την πρόγνωση διαφόρων τύπων καρκίνων μελετήθηκαν: α) τα επίπεδα της πρωτεΐνης DJ-1 στον ορό αίματος ασθενών με καρκίνο πριν και μετά την ανοσοθεραπεία με αναστολείς ανοσιακού σημείου ελέγχου (ICIs- Immune Checkpoint Inhibitors) και β) η πιθανή χρήση της πρωτεΐνης DJ-1 ως νέος προβλεπτικός και προγνωστικός καρκινικός βιοδείκτης χρησιμοποιώντας και τα σημερινά επιτεύγματα της νανοτεχνολογίας. Τέλος, μελετήθηκαν τα επίπεδα των λιπαρών οξέων βραχείας αλύσου (SCFAs- Short Chain Fatty Acids) στον ορό αίματος καρκινοπαθών που έλαβαν ανοσοθεραπεία και πώς αυτά επηρεάζουν τις ανταποκρίσεις στην θεραπεία. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ογκογενετικής πρωτεΐνης DJ-1 σε δείγματα ορού νεοπλασματικών ασθενών πραγματοποιήθηκε η μέθοδος της ανοσοπροσροφητικής ανάλυσης στερεάς φάσης με σύνδεση ενζύμου (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA) και, συγκεκριμένα, η υπο-μέθοδος Sandwich ELISA. Στη συνέχεια έγινε στατιστική ανάλυση των μετρήσεων με βάση διάφορα κλινοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών και την έκβαση της νόσου. Επιπρόσθετα συγκρίθηκαν τα αποτελέσματα της κλασσικής μεθόδου ELISA με τα αντίστοιχα από τη χρήση της φασματοσκοπίας Raman. Η φασματοσκοπία Raman είναι ένα σπουδαίο εργαλείο για τον ακριβή προσδιορισμό μοριακών συστημάτων μέσω δονήσεων χαρακτηριστικών ομάδων. Ιδιαίτερα χρησιμοποιήθηκε το φαινόμενο της επιφανειακής ενίσχυσης Raman (SERS-Surface Enhanced Raman Spectroscopy) με την ενστάλαξη ορού αίματος αλλά και της καθαρής πρωτεΐνης DJ-1 σε μεταλλικές νανοδομημένες επιφάνειες-πλασμονικά πλακίδια. H μέθοδος SERS αυξάνει κατά πολλές τάξεις μεγέθους την ευαισθησία της συμβατικής φασματοσκοπίας Raman και συνεπώς επιτρέπει την ανίχνευση μορίων εξαιρετικά χαμηλών συγκεντρώσεων. Για τον προσδιορισμό των λιπαρών οξέων βραχείας αλύσου χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της Υγρής χρωματογραφίας συζευγμένης με διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS): (Liquid Chromatography /Tandem Mass Spectrometry). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η πρωτεΐνη DJ-1 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτης που σχετίζεται με τον ιστολογικό τύπο(αδενοκαρκίνωμα), την εντόπιση(γυναικολογικός καρκίνος), κάποια κλινοπαθολογικά κριτήρια και την PTEN , ωστόσο δεν βρέθηκε συσχέτιση με την ανταπόκριση στην ανοσοθεραπεία, που σημαίνει ότι η χρήση της ως προβλεπτικός βιοδείκτης απάντησης στην ανοσοθεραπεία χρειάζεται μεγαλύτερη έρευνα. Όσον αφορά στα SCFAs φάνηκε ότι μόνο το βουτυρικό οξύ σημείωσε με την ανοσοθεραπεία στατιστικά σημαντική αύξηση των συγκεντρώσεων του στον ορό των καρκινοπαθών και μάλιστα σημειώθηκε στατιστικά σημαντική μεταβολή των επιπέδων του μεταξύ των δύο χρονικών στιγμών (p=0.003). Ωστόσο η αύξηση αυτή δεν συσχετίστηκε και με την αντίστοιχη απεικονιστική ανταπόκριση των ασθενών στη θεραπεία. Παρόμοια αποτελέσματα όσον αφορά στο βουτυρικό οξύ φάνηκαν και για την υποκατηγορία των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Εν κατακλείδι, από την μελέτη των φασμάτων Raman, από την ενστάλαξη δειγμάτων στις επιφάνειες των πλασμονικών πλακιδίων με νανοσωματίδια αργύρου, ταυτοποιήθηκε η χαρακτηριστική κορυφή(δακτυλικό αποτύπωμα) της πρωτεΐνης DJ-1 και επιπλέον σημειώθηκε πτώση αυτής της κορυφής μετά την ανοσοθεραπεία. Το τελευταίο μάλιστα αποτέλεσμα συμβαδίζει με το αντίστοιχο της ELISA καθιστώντας τα πλασμονικά πλακίδια και την SERS μια πολλά υποσχόμενη μέθοδο βιοανάλυσης.