Γονιδιωματική ρύθμιση της έκφρασης των ριβοσωμικών πρωτεϊνών: μοριακοί μηχανισμοί και φαρμακολογική αξιοποίηση στη θεραπευτική

Abstract

Ribosomes constitute the main macromolecular machines that catalyze protein synthesis within the cells of all domains of life. Each ribosome is assembled by the same set of 80 Ribosomal proteins- RPs and 4 ribosomal RNAs- rRNAs, which structurally associate into two subunits, the 40S and the 60S. Recently it has been revealed that mutations in ribosomal protein coding genes, the main components of the translational machinery, cause a group of pathologies termed ribosomopathies, as well as certain cancer types. Intriguingly, despite the ubiquitous expression of the associated ribosomal proteins, ribosomopathies mainly relate with toxicity in the red cell lineage and anemic clinical manifestations. An outstanding question that may shed light into ribosomopathies’ toxicity, is whether and how the ribosomal structure is altered during erythroid differentiation.This dissertation aims to address this issue by performing a detailed proteomic analysis of purified polysomes in an established model of erythroid differentiation (Murine Erythroleukemia Cells-MEL). Ribosomes were extracted out of different stages of differentiation through sucrose gradient ultracentrifugation, analyzed by label-free proteomics and combined with publicly available data through bioinformatic methods. Additionally, we sought for novel regulators of erythroid differentiation and thus focus on a specific microRNA molecule, miR-16-5p, with an interesting role in erythropoiesis and cancer. A main finding of the study was that erythroid differentiation associates with an extensive reprogramming of the overall ribosomal levels, characterized by an increase in monosomes and a decrease in polysomes. Moreover, the performed proteomic analysis identified 78 ribosomal proteins along with 1183 ribosome associated proteins (Raps). Notably, the main ribosomal structure, as assessed by the proteomic quantification of all ribosomal proteins, remained unaltered between immature and differentiated cells. This finding was verified through antibody detection of selected ribosomal proteins in the same samples. Moreover, a publicly available study was analyzed to reveal how ribosomal proteins are regulated in a whole-cell level derived out of 4 models of erythropoiesis. The latter analysis revealed that all RPs demonstrated excellent correlation in their expression levels between the samples, irrespective of their differentiation status. On the contrary, the ribosome-associated proteome, composed out of hundreds of proteins, seem to be dynamic and inconstant during erythroid differentiation. In total, 254 proteins demonstrated differential expression between the two samples, while 169 proteins were upregulated and 85 were downregulated. These factors functionally belong into various categories including RNA binding proteins, translational regulators as well as unexpected groups such as alternative splicing factors and mitochondrial proteins. Finally, miR-16-5p was identified as a strong regulator of erythroid differentiation by modulating ribosomal protein expression and its role was analyzed in the context of erythropoiesis and cancer development. In conclusion, the presented data suggests against a model of ribosome heterogeneity in erythropoiesis and proposes that alterations of the ribosomal levels as well as ribosome associated proteins are more important regulators of gene expression during differentiation. In total, this study represents a thorough analysis of the ribo-proteomic landscape and thus it enhances our understanding of ribosome regulation and deregulation in ribosomopathies and hematologic malignancies.

Τα ριβοσώματα αποτελούν εξαιρετικά συντηρημένες μοριακές μηχανές, υπεύθυνες για τη βιοσύνθεση των πρωτεϊνών σε όλα τα ζωντανά κύτταρα. Για την βιογένεση κάθε ριβοσώματος απαιτείται η στοιχειομετρική συναρμογή 80 ριβοσωμικών πρωτεϊνών (Ribosomal Proteins- RPs) και 4 ριβοσωμικών RNAs σε δυο ριβοσωμικές υπομονάδες, τις 40S και 60S. Πρόσφατες μελέτες καταδεικνύουν ότι οι μεταλλάξεις πολλαπλών RP γονιδίων σχετίζονται με την ανάπτυξη και την προώθηση μιας ομάδας γενετικών διαταραχών που ονομάζονται ριβοσωμοπάθειες καθώς και επίκτητων ασθενειών, όπως ο καρκίνος. Στις συγκεκριμένες ασθένειες διαπιστώνεται μια ευαισθησία της αναπτυξιακής διεργασίας της ερυθροποίησης, καθώς οι ασθενείς με ριβοσωμοπάθειες εκδηλώνουν σχεδόν αποκλειστικά αδυναμία παραγωγής ερυθρών αιμοσφαιρίων (ανεπαρκής ερυθροποίηση) χωρίς άλλες εμφανείς διαταραχές. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε μια λεπτομερής καταγραφή του ρόλου και της λειτουργίας του ριβοσώματος σε κύτταρα που υπόκεινται ερυθροκυτταρική διαφοροποίηση, της διαδικασίας δηλαδή η οποία απορρυθμίζεται δραματικά σε ασθενείς με ριβοσωμοπάθειες. Ως εκ τούτου, κεντρικοί στόχοι της διατριβής αποτελούν: α) Η καταγραφή των επιπέδων των ριβοσωμάτων, β) ο λεπτομερής χαρακτηρισμός της ριβοσωμικής σύνθεσης, μέσω της πρωτεϊνωματικής ανάλυσης απομονωμένων ριβοσωμάτων από στάδια της ερυθροκυτταρικής διαφοροποίησης και γ) Ο εντοπισμός ρυθμιστών της ριβοσωμικής βιογένεσης με στόχο την φαρμακολογική αξιοποίησή τους στις ριβοσωμοπάθειες ή στον καρκίνο. Για την επίτευξη των παραπάνω στόχων αξιοποιήθηκαν καθιερωμένα κυτταρικά μοντέλα της ερυθροκυτταρικής διαφοροποίησης, ιδιαιτέρως η ερυθρολευχαιμική σειρά Murine Erythroleukemia (MEL) Cells. Για την μελέτη των ριβοσωμάτων καθιερώθηκε και εκτελέσθηκε ένα πρωτόκολλο απομόνωσης βασισμένο στην υπερφυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας σακχαρόζης. Τα απομονωμένα και καθαρισμένα ριβοσώματα αναλύθηκαν με τη χρήση της τεχνικής φασματομετρίας μάζας σε σειρά. Παρατηρήθηκε ότι τα ριβοσώματα υφίστανται αυστηρή ρύθμιση στη διάρκεια της διαφοροποίησης, που χαρακτηρίζεται από αύξηση των επίπεδων των μονοσωμάτων και μείωση των πολυσωμάτων. Επιπλέον, στα πλαίσια της πρωτεϊνωματικής ανάλυσης των ριβοσωμάτων στα MEL κύτταρα εντοπίσθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν 78 ριβοσωμικές πρωτεΐνες και 1183 πρωτεΐνες που συνδέονται με το ριβόσωμα. Η ποσοτική πρωτεϊνωματική ανάλυση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών ανέδειξε ότι η στοιχειομετρία της βασικής δομής του ριβοσώματος (των 78 ριβοσωμικών πρωτεϊνών) παραμένει αμετάβλητη στην διάρκεια της ερυθροδιαφοροποίησης. Η συγκεκριμένη παρατήρηση επιβεβαιώθηκε με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων έναντι 7 ριβοσωμικών πρωτεϊνών καθώς και με την ανάλυση δημοσιευμένων πρωτεϊνωματικών δεδομένων από 4 επιπλέον κυτταρικά μοντέλα της ερυθροκυτταρικής διαφοροποίησης. Ακόμη, διερευνήθηκε η ρύθμιση των πρωτεϊνών που συνδέονται με το ριβόσωμα στα απομονωμένα ριβοσώματα των MEL κυττάρων. Στο πλαίσιο αυτής της ανάλυσης παρατηρήθηκε ότι οι 169 πρωτεΐνες ρυθμίζονται θετικά και οι 85 πρωτεΐνες μειώνουν τη συνδεσιμότητά τους με το ριβόσωμα στα διαφοροποιημένα κύτταρα. Η μοριακή λειτουργία των παραπάνω πρωτεϊνών βρέθηκε να αφορά ενδοκυτταρικές λειτουργίες, όπως η σύνδεση με RNA, το εναλλακτικό μάτισμα και η μιτοχονδριακή λειτουργία. Τέλος, παράλληλα με την εκτέλεση του κύριου μέρους της παρούσας διδακτορικής διατριβής, στο πλαίσιο του εντοπισμού ρυθμιστών της ερυθροδιαφοροποίησης που επηρεάζουν τη λειτουργία του ριβοσώματος, πραγματοποιήθηκε λεπτομερής καταγραφή της δράσης του microRNA: miR-16-5p σε διάφορα καρκινικά κυτταρικά μοντέλα. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ένα πολύπλευρο ογκοκατασταλτικό ρόλο του miR-16-5p σε κύτταρα ερυθρολευχαιμικά και καρκίνου του μαστού. Συνολικά, η παρούσα διατριβή αποτελεί μια ολοκληρωμένη ανάλυση του πρωτεϊνωματικού φάσματος του ριβοσώματος στην ερυθροδιαφοροποίηση με σημαντικές προεκτάσεις για την κατανόηση των ριβοσωμοπαθειών και των αιματολογικών νεοπλασιών.