Η δράση των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων με ή χωρίς πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια στην επούλωση αναστομώσεων φλεγμονώδους παχέος εντέρου σε επίμυες

Abstract

Introduction: Multiple factors have been linked with increased risk of anastomotic leak in bowel surgery, including infections, inflammatory bowel disease, patient comorbidities and poor surgical technique. The aim of this study was to investigate the positive effect, if any, of adipose derived mesenchymal stem cells (MSCs) mixed with platelet-rich plasma (PRP) in the healing of bowel anastomoses, in an inflammatory environment after establishment of experimental colitis. Materials and Methods: 35 male Wistar rats were divided intο 5 groups of 7 animals: normal controls (n=7), TNBS colitis controls (n=7), PRP (n=7), MSCs (n=7), and PRP+MSCs (n=7). In addition, 5 rats were used initially for MSCs isolation and PRP preparation. All groups underwent laparotomy, 1 cm segmental colectomy and anastomosis in situ. In the colitis groups, colectomy was performed at the affected area. Colitis was previously established by transrectal administration of 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) except for the normal controls. Post-mortem histopathological, tissue hydroxyproline and anastomotic bursting pressure (ABP) assessments were performed. The Mann-Whitney U test was used to assess statistical significance differences between groups. Results: No perioperative mortality was noted. No significant difference were noted in the perioperative complications. Tissue hydroxyproline and ABP were significantly increased in the group of PRP+MSCs compared to colitis controls (p = 0.0151 and p = 0.0104, respectively). Inflammatory cell infiltration was lower and fibroblast activity higher in PRP+MSCs group compared to colitis control group, but not statistically significant (p > 0.05). Neoangiogenesis (p = 0.0073) and anastomotic area epithelialization (p = 0.0182) were significantly higher in PRP + MSCs group compared to colitis controls. Immunohistochemistry for CD20 and CD34 showed lower inflammatory cell infiltration and increased vascular deposition in the PRP+MSCs group compared to colitis control group. Furthermore, Masson`s trichrome immunochemical stain showed intense collagen deposition, higher in PRP+MSCs group compared to colitis control group. Discussion: The synergistic effect of the PRP and MSCs is apparently responsible for the improved healing markers in bowel anastomoses even on inflammatory bowel. Our findings show a significant increase in neovascularization, epithelialization, anastomosis bursting pressure and hydrxzyproline in the PRP+MSCs group compared to colitis control. This gives hope for primary anastomoses and stoma saving in many emergency and/or elective circumstances, especially in immunocompromised or malnourished patients, even in cases with inflammation or peritonitis. Clinical studies should follow in order to support the clinical application of PRP+MSCs in gastrointestinal anastomoses.

Εισαγωγή: Πολλοί παράγοντες έχουν συνδεθεί με αυξημένο κίνδυνο αναστομωτικής διαφυγής στη γενική χειρουργική, συμπεριλαμβανομένων των λοιμώξεων, της φλεγμονώδους νόσου του εντέρου, των συννοσηροτήτων και της κακής χειρουργικής τεχνικής. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση της θετικής επίδρασης, εάν υπάρχει, των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων λιπώδους προέλευσης (MSCs) αναμεμειγμένων με πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια (PRP) στην επούλωση των αναστομώσεων του εντέρου, σε ένα φλεγμονώδες περιβάλλον μετά την εγκατάσταση πειραματικής κολίτιδας. Υλικά και Μέθοδοι: 35 αρσενικοί επίμυες Wistar χωρίστηκαν σε 5 ομάδες των 7: ομάδα ελέγχου (φυσιολογικοί μάρτυρες, n=7), ομάδα ελέγχου TNBS κολίτιδας (n=7), PRP (n=7), MSCs (n=7) και PRP+MSCs (n=7). 5 ανεξάρτητοι επίμυες χρησιμοποιήθηκαν ως δότες για την παραγωγή PRP και MSCs. Όλες οι ομάδες υποβλήθηκαν σε λαπαροτομία, τμηματική κολεκτομή 1 cm και τελικοτελική αναστόμωση in situ. Σε όλες τις ομάδες που αναπτύχθηκε κολίτιδα, η τμηματική κολεκτομή πραγματοποιήθηκε στην περιοχή της φλεγμονής. Kολίτιδα που προσομοιάζει με κολίτιδα Crohn πραγματοποιήθηκε με διορθική χορήγηση 2,4,6-τρινιτροβενζολοσουλφονικού οξέος (TNBS), σε όλους τους επίμυες εκτός των φυσιολογικών μαρτύρων. Η θυσία πραγματοποιήθηκε την 7η ημέρα με μέτρηση ιστοπαθολογικών παραμέτρων, προσδιορισμό της υδροξυπρολίνης στην περιοχή της αναστόμωσης και μέτρηση της πίεσης διάσπασης της αναστόμωσης (ABP). Το τεστ Mann-Whitney U χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των διαφορών στατιστικής σημαντικότητας μεταξύ των ομάδων. Αποτελέσματα: Δεν σημειώθηκε περιεγχειρητική θνητότητα και δεν ανευρέθηκαν σταστιστικώς σημαντικές διαφορές στις μετεγχειρητικές επιπλοκές μεταξύ των ομάδων. Η υδροξυπρολίνη ιστού και η ABP αυξήθηκαν στατιστικώς σημαντικά στην ομάδα των PRP+MSCs σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου TNBS κολίτιδας (p = 0,0151 και p = 0,0104, αντίστοιχα). Η διήθηση των φλεγμονωδών κυττάρων ήταν χαμηλότερη και η δραστηριότητα των ινοβλαστών υψηλότερη στην ομάδα PRP+MSCs, αλλά όχι στατιστικώς σημαντική (p > 0,05). Η νεοαγγειογένεση (p = 0,0073) και η επιθηλιοποίηση (p = 0,0182) της αναστομωτικής περιοχής ήταν σημαντικά υψηλότερες στην ομάδα PRP + MSCs σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου TNBS κολίτιδας. Η ανοσοϊστοχημεία για τα CD20 και CD34 έδειξε χαμηλότερη διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων και αυξημένη αγγειακή εναπόθεση στην ομάδα PRP+MSCs σε σύγκριση με τον ομάδα ελέγχου TNBS κολίτιδας. Επιπλέον, η τρίχρωμη χρώση Masson’s έδειξε έντονη εναπόθεση κολλαγόνου, υψηλότερη στην ομάδα PRP+MSCs σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου TNBS κολίτιδας. Συζήτηση: Η συνεργική δράση των PRP και MSCs είναι προφανώς υπεύθυνη για τους βελτιωμένους δείκτες επούλωσης στις αναστομώσεις του φλεγμονώδους εντέρου, όπου κανονικά δεν θα διενεργούνταν αναστόμωση. Τα ευρήματά μας δείχνουν σημαντική αύξηση στη νεοαγγείωση, την επιθηλιοποίηση, την πίεση διάσπασης και την υδροξυπρολίνη στην ομάδα PRP+MSCs σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Αυτό δίνει ελπίδα για εξ αρχής διενέργεια αναστομώσεων και αποφυγή στομιών σε πολλές επείγουσες ή/και προγραμματισμένες χειρουργικές επεμβάσεις, ειδικά σε ανοσοκατεσταλμένους ή υποσιτισμένους ασθενείς, ακόμη και σε περιπτώσεις με φλεγμονή ή περιτονίτιδα. Θα πρέπει να διεξαχθούν κλινικές μελέτες προκειμένου να υποστηριχθεί η κλινική εφαρμογή των PRP+MSCs σε εντερικές αναστομώσεις σε ανθρώπους.